$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Yeni Bir Cerrahi Prosedürle Sıvı Görüntüleme Kolonu Altındaki Böbreğe Lateral Pipet Erişimi
NOT: Görüntüleme destek sisteminin montajı ve cerrahi hazırlık Şekil 1'de gösterilmiştir. Açıklanan prosedür, 20-25 g ağırlığındaki C57BL/6 fareler üzerinde gerçekleştirilir.
- Fareyi tartın.
- % 4 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin ve% 1.5-2.5 izofluran ile hava / oksijen karışımında koruyun. Ağrılı uyarana yanıt verilmemesi ve solunum hızının azalması nedeniyle farenin uyuşturulduğunu doğrulayın.
- Gözleri yağlayın ve hayvanı bir taban plakası üzerine yanal olarak yerleştirin. Bant kullanarak 4 ekstremiteyi hareketsiz hale getirin.
- Deri altına 200 μL normal salin enjekte edin ve bir rektal sıcaklık probu yerleştirin. Ameliyat sırasında bir ısıtma lambası ve görüntüleme sırasında bir ısıtma yastığı kullanarak sıcaklığı kontrol edin.
- Tüy dökücü bir krem kullanarak farenin sol tarafındaki tüm tüyleri alın.
- Derinin altında görünen dalağı bulun ve dalağın dorsal ve kaudal tarafındaki sol böbreği bulun.
- Deride 0,5 cm'lik bir kesi ve peritonda daha küçük bir kesi yapın, böbreğin kolayca itmesine yetecek kadar kesin.
- Böbreği hafif bir basınçla ekstrüde edin. Polisiloksan ile yapılan böbrek stabilizatör formunu böbreğin etrafına yerleştirin ve siyanoakrilat yapıştırıcı ile sabitleyin. Böbreği, böbreğin en yan yüzeyi stabilizatörün ötesine yaklaşık 1 mm uzanacak şekilde ara parça ile hizalayın.
- Bir kafa plakasını yapıştırıcı ile sabitleyici formuna sabitleyin ve kafa plakasını taban plakasındaki montaj çubuklarına monte edin.
- Böbreği çevreleyen polisiloksan desteğindeki kuyucuğu %1 agaroz solüsyonu ile doldurun ve 10 mm'lik lameli üstüne yerleştirin ve agaroz sertleşene kadar tutun. Lameli baş plakasına yapıştırıcı ile kapatın ve lamel etrafında diş çimentosu ile bir halka oluşturun.
- FITC-dekstran (2.000.000 Da,% 5 çözelti, 100-150 μL) retro-orbital olarak enjekte edin ve fareyi ve sabitleme plakasını hızlı bir şekilde 2 fotonlu mikroskop aşamasına getirin, anesteziyi koruyun ve mikroskop aşamasında yeterli atık gaz süpürücüsünü sağlayın.
2. Bowman's Space'e Uygun Glomerulus ve Pipet Seçimi
- tanımlar:
- X'i ekranda sol-sağ ve mikroskoba bakacak şekilde sol-sağ olarak tanımlayın
- Sahne denetleyicisinden SX'i (aşama X) okuyun
- PX'i pipet kadranı kontrol cihazında pipet X olarak tanımlayın
- Y'yi ekranda yukarı-aşağı ve mikroskoba doğru ileri ve 2 foton kurulumuna doğru geri olarak tanımlayın
- Z'yi tavana doğru, yere doğru aşağı doğru ve objektif Z konumu ile sahnede ölçülen olarak tanımlayın.
- S(O)Z'yi sahne (gerçekten amaç) yüksekliği olarak tanımlayın.
- Okülerdeki yeşil floresan protein (GFP) filtre ayarları kullanılarak tanımlanabilen böbreğin yüzeyini bulun. FITC-Dekstran enjeksiyonu nedeniyle, damar sistemi parlak yeşil olacaktır.
- Uygun bir glomerulus belirleyin. Oküler kullanarak böbreğin yüzeyini belirledikten sonra, 2 fotona (taramasız mod) geçin ve görüntüleme penceresini keşfedin. Mikroponksiyon için uygun özellikler şunlardır: lamelin altındaki dikey mesafe >30 μm (erişim sırasında pipet ve lamel arasındaki çarpışmayı önlemek için) ve lateral böbrek kapsülünden glomerulusa yanal mesafe <400 μm (bu mesafenin ötesinde pipetin sapması ıskalama olasılığını artırabilir).
- Böbrek kapsülü üzerinde doğrudan glomerulusun pipet tarafına giden bir nokta olan delinme noktasına olan yanal ve dikey mesafeyi kaydedin.
- Objektif odak noktasını su sütununa doğru yükseltin, x ve y aşama koordinatlarını değiştirmeden, sadece bir santimetre kadar tutun.
- Pipet ucunu su sütununa sürün ve 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) uyarımını açın. Pipeti x ve y boyutlarında, ucun maksimum floresan noktasına getirin, bu hedefin merkezi olacaktır. Bu hassas ön konumlandırma olmadan pipeti oküler içinde bulmak zordur. Kuantum noktaları, uyarma dalga boyundan bağımsız olarak aynı (bu durumda kırmızı) dalga boyunda floresan yayıldığından, DAPI uyarımı, Şekil 2'de gösterildiği gibi, uca sıkıca odaklanan kırmızı floresan üretir.
- Uyarma ayarını kırmızı floresan proteini (RFP) olarak değiştirin ve pipeti oküler görünümde görselleştirin, ardından oküler görünümde tam olarak ortalayın.
- 2 fotona geçin ve 2 fotonun altındaki pipeti bulun ve tam olarak görüntünün merkezine yerleştirin. Bu kayıt pozisyonudur.
- Pipetin bir görüntüsünü kaydedin.
- Aşamayı ve mikropipet kontrol cihazı koordinatlarını kaydedin.
not: Aşama ve pipet koordinatları arasındaki uzaklığı hesaplamak ve pipet denetleyicisinin hedef koordinatlarını hesaplamak için JavaScript kodu kullanarak hesaplamalar yapacak ek .html dosyasını (elektronik tablo yazılımı yüklü olmayan sistemlerde avantajlıdır) veya bir elektronik tablo kullanın.
- Pipeti, z ve y'yi aynı tutarak x eksenindeki su sütunundan çıkarın.
- Pipet Z'yi hedef glomerulus Z'ye hareket ettirin (yani, pipeti lamel altında Z yönünde aşağı doğru hareket ettirin)
- Pipet Y'yi hedef glomerulus Y koordinatına taşıyın.
- 2 fotonlu canlı görüntüyü hedef glomerulus Z'ye ve ardından böbreğin kenarına taşıyın ve SX'i not edin.
- Kayıt SX'inden ofseti kullanarak böbrek kenarı PX'i hesaplayın.
- Sahneyi pipete doğru hareket ettirin (SX'i artırın), böylece böbreğin kenarı ekranın çok solunda olacak, ancak yine de görünür olacak.
- Pipeti, yukarıda hesaplanan böbrek kenarı PX'ten yaklaşık 100 μm daha az olacak şekilde hızlı bir şekilde ilerletin.
- Pipeti yavaşça ilerleterek pipet ucunu bulun. Kırmızı kazancını artırın ve kırmızı piksel histogramını izleyin (kuantum noktalarının aşırı parlaklığı ve hedef dışı floresan nedeniyle pipet pencerede görüntülenmeden önce piksel dağılımı kayar).
- Canlı 2 fotonlu görüntüleme altında böbrek kenarına ilerleyin.
not: Böbrek kapsülüne girmeden önce, pipeti Y ve Z boyutlarında yönlendirmek mümkündür. Ancak bu, pipet ucunu kırabilir. Pipet hedef dışıysa, daha muhafazakar bir önlem, X boyutunda 2 cm'ye kadar geri çekmek, yeniden yönlendirmek ve ardından X boyutunda böbrek kenarına geri dönmektir. Pipet doku içine girdikten sonra, X dışındaki herhangi bir eksendeki hareket, kullanmak için büyük deneyim gerektiren ve sıklıkla kırılmaya yol açan pipet fleksiyonuna yol açar.
- Pipeti X ekseninde yavaşça glom hedefi PX'e doğru sürün ve gözünüz SX'in üzerinde olsun. (Mikropipetin yerleştirilmesinden sonra hiç kaymış olup olmadığını görmek için ara sıra glomerulusa geri dönmek faydalı olacaktır).
- Doğru konumda olduğunuzda, konumu bir z-stack.
not: Mikropipet yerindeyken, ilaçlar, proteinler veya floresan izleyiciler enjekte edilebilir, daha sonra analiz için sıvı aspire edilebilir veya başka bir elektroda göre basınç veya yük ölçülebilir.
3. Bowman'ın Uzayından Sıvı Aspirasyonu
- Pipetin açıklığını sağlamak ve giriş sırasında pipetin tıkanmasından kaynaklanan karışıklığı azaltmak için mikro pompayı 2 dakika boyunca 100 nL perflorodekalin enjekte edecek şekilde ayarlayın. Pipet konumunu sağlamak için yeniden görüntüleyin.
- Ek filtreleme için 4-6 dakika bekleyin.
- Mikro pompayı 50 nL/dk'ya kadar bir hızda 300 nL'ye kadar aspire edecek şekilde ayarlayın.
not: Bu oranda glomerüler morfolojideki değişiklikler gözlenmez, bu da aspirasyon sırasında sıvının boşluğa verilme hızını değiştirmediğini düşündürür. Konvansiyonel mikroponksiyonda olduğu gibi bir yağ bloğu olmadığından, kütle spektrometresi için gerekli olan bu hacmin geri kazanımı, enjekte edilen perflorodekalinin ve muhtemelen tübüler sıvının bir kısmını içerebilir. İyona duyarlı elektrot ölçümleri, floresan spektroskopisi, polimeraz zincir reaksiyonu ve diğer hassas uç noktalar gibi tahliller için daha düşük hacimler kullanılabilir. Kütle spektrometresi son nokta değilse, depolamadan önce aspire edilen hacmi ölçmek için mineral yağ ve standart mikropunktur teknikleri kullanılabilir.
- Bir kez daha görüntü.
- Pipeti geri çekin ve numuneyi koruyun, TRIS tamponu ekleyin ve analizden önce -80°'de saklayın.
- Aşırı dozda izofluran veya başka bir onaylanmış yöntem kullanarak fareyi ötenazi yapın.
not: Filtrat, glomerüler kılcal damarlardan süzülerek boşluğa girer. Farelerde tek nefron glomerüler filtrasyon hızı (SNGFR) 8-14 nL / dak arasında rapor edilmiştir. Bununla birlikte, sığırcık kuvvetleri SNGFR'yi yönetir ve bu nedenle Bowman'ın uzayındaki negatif hidrostatik basınç SNGFR'yi artırabilir. Standart mikroponksiyon yöntemleri, boru şeklindeki sıvı örneklemesi için yağ ve nötr basınç ile boru şeklinde blokaj kullanır, ancak bu bileşikler kütle spektrometresine müdahale eder (aşağıya bakınız); Bu nedenle, bu teknikte erken proksimal tübül patent olarak kalır. Ayrıca, aspirasyon anında, Bowman'ın uzayı bilinmeyen, ancak pozitif bir süzüntü hacmi içerir. Bu nedenle, sıvı aspirasyon hızı SNGFR.
aşabilir
not: Burada açıklanan deneylerde amaç, nanoproteomik tekniklerle kütle spektrometresi analizi için normalden daha büyük bir glomerüler filtrat örneği elde etmekti. Kütle spektrometresinin kullanılması, mineral yağ veya balmumu içeren yağ bloklarının (kütle spektrometresinde sinyal: gürültüyü azaltan organik moleküllerin karmaşık karışımları) kullanımını engellediğinden, mikropipet ve şırıngayı doldurmak için perflorodekalin kullanılır. Perflorodekalinin boru şeklindeki akışı engellediği bilinmemektedir, ancak biyolojik olarak inerttir ve kütle spektrometresine müdahale etmez.
