Tavuk TAT'ta Renal Organotipik Kültür: Renal Vasküler Mimari Oluşumunu İndüklemek İçin Tavuk TAT'ta Murin Böbrek Eksplantlarının Transplantasyonu İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Kaisto, S. et al. Vaskülarizasyon, Genişletilmiş Gelişim ve Gelişmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, kuş embriyolarından alınan koryoallantoik membran (CAM) üzerinde geliştirilmiş bir ksenotransplantasyon kurulumu kullanılarak organ gelişimini incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tamamen vaskülarize kültürlenmiş embriyonik organların ve organoidlerin geliştirilmesine izin verir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir

.

1. Tavuk CAM'de Fare Embriyonik Böbreklerinin ve Renal Organoidlerinin Yetiştirilmesi için Mini Rezervuarların İmalatı ve Ksenotransplantasyon Deneylerinin Kurulması

1. 6 oyuklu veya 12 oyuklu plakalar için tasarlanmış transwell hücre kültürü ekleri kullanın.
   not: Özel deneye bağlı olarak, büyük veya küçük mini rezervuarlar kullanılabilir. Sekiz embriyonik böbreğe kadar ksenogreftleme için veya aynı tavuk embriyosuna birkaç mini rezervuar yerleştirileceği zaman (örneğin, aynı tavuk CAM üzerinde deney ve kontrol örnekleri) küçük mini rezervuarlar kullanmak en iyisidir.
2. Üzerine geçirgen bir zar takılmış 2 mm yüksekliğinde plastik bir halka oluşturmak için daire testere bıçağına sahip döner bir çok amaçlı alet veya bir el testeresi kullanarak eklerin kenarlarını kesin.
3. Bu mini rezervuarların kenarlarını bir neşter veya keskin bir bıçakla cilalayın.
4. Mini rezervuarları en az 1 saat% 70 etanol içinde sterilize edin.
5. Mini rezervuarları otoklavlanmış çift damıtılmış suda yıkayın ve laminer bir başlıkta kurumaya bırakın.
6. Mini rezervuarları PBS ve kültür ortamında durulayın (yüksek glikozlu DMEM /% 10 FBS /% 1 penisilin-streptomisin).
7. Rezervuarı, zar yukarı bakacak şekilde bir damla (600 μL / 400 μL) kültür ortamının üzerine bir Petri kabına yerleştirin.
8. Disseke edilmiş ex vivo embriyonik böbrekleri veya renal organoidleri bir pipet veya cam kılcal tüp yardımıyla zar üzerine eşit şekilde yerleştirin. Böbreklerin etrafında çok fazla sıvı bırakmaktan kaçının.
9. Numunelerin 37 ° C'de ve% 5 CO₂.
   'de bir hücre kültürü inkübatöründe 2-24 saat boyunca zara yapışmasına izin verin not: Küçük ek parça üzerinde sekiz adede kadar E11.5 embriyonik fare böbreği veya böbrek organoidi düzenlenebilir. Ksenotransplant için daha büyük embriyonik doku parçaları veya CAM'ın daha geniş bir alanında bir hücre-hidrojel karışımı kullanılacaksa, büyük ek parça önerilir.
10. Daha önce yayınlanmış yöntemlere göre hazırlanmış 8 günlük ex ovo kültürlenmiş embriyonik tavukları hücre kültürü inkübatöründen çıkarın
11. Mini rezervuarları, greftler CAM'a bakacak ve zar bunları kaplayacak şekilde CAM'a aktarın. Mini rezervuarları, tavuk embriyosunu örtmeyecek şekilde CAM'ın çevresine yerleştirin.
    not: 12 oyuklu plakalar için transwell eklerinden üretilen daha küçük mini rezervuarlar kullanıldığında, bir CAM üzerine üç adede kadar mini rezervuar yerleştirilebilir.
12. Mini rezervuarlara 500 μL (6 oyuklu uç) veya 300 μL (12 oyuklu uçlu) kültür ortamı ekleyin.
13. Numuneleri en fazla 9 gün boyunca tavuk CAM üzerinde yetiştirin. Mini rezervuarlardaki kültür ortamını günlük olarak değiştirin.
    not: Numunelerin vaskülarizasyonu, transplantasyondan 24-48 saat sonra gözlemlenebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre İnkübatörü	Panasonic Belediyesi	13090543	37°C, %90 nem, %5 CO₂ olarak ayarlanmış sıcaklık
Hücre İnkübatörü	SANYO	10070347	Tavuk CAM kültürü kuluçka makinesi. 37°C, %90 nem, %5 CO₂ olarak ayarlanmış sıcaklık
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı	Sigma	D777	Yüksek glikoz
Etanol (%70)	VWR (VWR)
Fetal Sığır Serumu	HyClone (Klon	SH3007003HI Termo Bilimsel
Forseps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Pbs-/-	Corning	20-031-Özgeçmiş
PBS +/+	Biyobatı	X0520-500	Mini rezervuarların yıkanması.
Penisilin ve Streptomisin	Sigma	P4333 Serisi
Thincert 0,4 μm Gözenekli Polistiren Membranlı 12 Kuyulu Hücre Kültürü Ekleri	Greiner Bio-Bir	665641
Thincert 0,4 μm Gözenekli Polistiren Membranlı 6 Kuyulu Hücre Kültürü Ekleri	Greiner Bio-Bir	657610

Serisi ) Serisi