$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. CTC'lerin hazırlanması
- Enjeksiyon için gereken CTC sayısını hesaplayın ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1.0 ×10 4 hücre / μL'de tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın. Hücre süspansiyonunu prosedür boyunca buz üzerine veya 4 °C'ye yerleştirin.
not: Tripsinizasyon gerektiren hücre hatlarını kullanırken, tripsini çıkarmak için hücreleri steril PBS ile iki kez yıkadığınızdan emin olun. Bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımı yapın. Büyük bir kohort (>50 fare) kullanılıyorsa, fare başına tutarlı sayıda hücre uygulandığından emin olmak için hücreleri yeniden sayın ve enjeksiyonlar arasında hücre canlılığını doğrulayın.
2. Cerrahi Öncesi İşlem
- Fareye deri altına 5 mg / kg buprenorfin sürekli salımlı (Bup-SR) enjekte edin.
not: Önerilen insizyon alanını enjekte etmeyin; Kürek kemiğinden çok uzakta bir enjeksiyon bölgesi seçin.
- Fareyi% 2-3 izofluran ile doğrultma refleksi belirtisi göstermeyene kadar uyuşturun. Ek olarak, anestezi durumunu doğrulamak için kuyruk ve/veya pençe kıstırma refleksini kontrol edin.
- Fareyi ameliyat alanından uzak bir yerde ameliyat için hazırlayın. Kürkün kesi bölgesini kirletmesini önlemek için cerrahi bölgeyi (yani kafatasının sırt yüzeyi) yeterli sınır alanı ile klipsleyin; Daha sonra, siteyi antiseptik antiseptik ile doyurun, sitenin merkezinden çevreye doğru çalışın ve kurumasını bekleyin. Cerrahi bölgeyi kontaminasyondan korumak için steril örtü veya steril arkası yapışkanlı plastik örtü malzemesi uygulayın.
not: Aletler önceden otoklavlanmalı ve uçlar bir cam boncuk sterilizatörü kullanılarak hayvanlar arasında yeniden sterilize edilmelidir.
- Başın tüm ventral yüzeyinin kürkünü tıraş edin ve steril tekniği kullanarak cildi hazırlayın.
- Burnu, stereotaktik aparatın modifiye edilmiş L şeklinde bir burun konisi ile konumlandırın ve burun kaslarının açık ve net kalmasını sağlayın. Her iki kulak kepçesinin ventral yüzeyleri boyunca bant kullanarak, burun konisine sabitlemek için cildi nazikçe öne doğru çekin ve sabitlendikten sonra boynu yaklaşık 90°'lik bir açıyla bükün. Anesteziyi sürdürmek için% 1.5 izofluran uygulayın.
not: Doğru konumlandırma, insizyon alanının, oksipital kemiğin kaudal sırtının kolayca tanımlanmasına izin verecek şekilde sunulmasıyla sonuçlanacaktır.
- Omurganın cisterna magna ile aynı seviyede tutulduğundan emin olmak için vücudu konumlandırın ve kuyruğa hafif bir çekiş uygularken, sabitlemek için kuyruk tabanına bant yerleştirin.
>3. Cerrahi Sarnıç Magna Enjeksiyonu
- Boyun tam ekstansiyonda ve kulak kepçesinin hemen arasından başlayarak, cerrahi makas uçlarını oksipital kemik boyunca hafif bir basınçla aşağı doğru hareket ettirin.
not: Bu orta hat pozisyonundayken, makas uçları cisterna magna üzerindeki içbükey alana daldırıldığında küçük bir çöküntü fark edilir.
- Palpe edilen içbükeyliğin hemen üzerinde 3-5 mm'lik küçük bir orta hat kesisi yapın. 30 G Hamilton şırıngaya 1.0 ×10 4 hücre / μL'de (toplam 5.0 × 104 hücre) 5 μL hücre süspansiyonu çekin.
- Cisterna magna'ya hafifçe bastırmak için 1-2 mm uçlu küt uçlu forseps kullanın. Uçları kapalı bir konumda yerleştirin ve dura üzerine aşağı doğru baskı uygularken açın.
- Dural membran kolayca tanımlanana ve ilişkili kan damarları açıkta kalan alanda görünene kadar önceki adımda açıklanan künt diseksiyonu tekrarlayın.
not: Ortaya çıkan enjeksiyon penceresi, iğne yerleştirme sırasında kan damarlarının zarar görmemesini sağlar.
- Çevredeki kas sistemini geri çekmek için forsepsleri açık tutarken, eğimi görselleştirmek için duranın altına 30 G'lik karot almayan bir iğne sokun. İğnenin yalnızca eğimin hemen ötesine sokulduğundan emin olun. Bir şırınga pistonunu yavaşça yerleştirin ve hücreleri dura'nın hemen altına yerleştirin.
- Duranın altındaki enjeksiyonu gözlemlemek için eğimi uygun şekilde yerleştirin. Tekniği dikkatli bir şekilde uygulayın ve membranın zarar görmesini önlemek ve minimum sızıntıyı sağlamak için 30 G karotsuz iğneyi kullanın. Sızıntı fark edilirse, pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif bir baskı uygulayın.
- Bir yara klipsi veya mikro damla cilt yapıştırıcısı uygulayarak cildi kapatın. Enjeksiyon başarılı bir şekilde gerçekleştirildikten sonra, farelerin ılık bir battaniye üzerinde anesteziden kurtulmalarına izin verin, sternal pozisyonu koruyana ve amaçlı hareket gösterene kadar sürekli olarak gözlemleyin.
- Ameliyattan sonra ilk hafta fareleri günlük olarak izleyin. Bir fare ağrı veya sıkıntı içinde görünüyorsa, veteriner konsültasyonu ve direktifine bağlı olarak 5 güne kadar her 12 ila 24 saatte bir 10 mg / kg deri altı carprofen enjeksiyonu ile tedavi edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce farelerin iyileşmesine izin verin ve en az 48 ila 72 saat izleyin.
not: Önleyici olarak verilen Bup-SR, 72 saate kadar sürecektir, bu nedenle normalde ek analjezikler gerekli değildir. Bununla birlikte, hayvanlara gerektiği kadar ek analjezikler sağlanacaktır (uyuşuksa, yemek yemiyorsa, karıştırılmışsa). Bir cerrahi bölge postoperatif enfeksiyon belirtileri geliştirirse (ör., kızarıklık, şişme, hassasiyet, allodini, hiperaljezi, hiperpati veya süpürasyon) veya fare etkilenen bölgeyi koruyorsa, fareyi ötenazi yapın. Kanser hücreleri BOS'a başarılı bir şekilde enjekte edilirse, 1 veya 2 hafta içinde CNS'de LMD ve tümör ilerlemesi gelişecektir (CTC'lerin tipine veya kullanılan hücre hattına bağlı olarak) (Şekil 1).
