Farede İntraserebroventriküler Enjeksiyon: Fare Beyninin Serebral Ventriküllerine İlaç Vermek İçin Ommaya Aracılı Doğrudan İlaç Uygulama Yöntemi

Özet

Kaynak: Law, V. et al. Leptomeningeal Hastalığın Doğrudan Hedefli Tedavisini İncelemek İçin Bir Murine Ommaya Ksenogreft Modeli. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, bir fare modelinde ommaya aracılı intraserebroventriküler enjeksiyonu göstermektedir. Yöntem, potansiyel ilaç adaylarının lokalize olarak verilmesini sağlar ve kan-beyin bariyerinden kaçar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Murine Ommaya Meclisi ve İmplantasyonu

1. İstasyonun hazırlanması
   1. İstasyon yüzeyini dezenfekte edin. Yüzeyin üzerine mavi bir örtü yerleştirin ve Şekil 1'de gösterilen tüm sterilize edilmiş alet ve malzemeleri hazır bulundurun.
2. Cerrahi öncesi prosedür
   1. Analjezi (Bup-SR) uygulayın ve steril cerrahi ortamı koruyun.
3. Murine Ommaya'nın cerrahi implantasyonu
   1. Murine Ommaya enjeksiyon cihazını 25G (0.51 mm dış çap) minyatür enjeksiyon portu ve 1 mm ara disk kullanarak monte edin. Metal kanülün yaklaşık 2.5 mm'lik kısmının sağ serebral hemisfere nüfuz etmesini sağlamak için siyanoakrilat steril bir yapıştırıcı kullanın (Şekil 2A–C).
      not: Bu laboratuvarda, her iki parçanın da (minyatür enjeksiyon portu ve ara parça) tek bir ünite olarak 3D olarak basılmış olduğu MRI uyumlu bir Fare Ommaya prototipi geliştirilmiştir (Şekil 2D). Tek ünite versiyonu MRI ile test edilmiştir ve montaj adımını ortadan kaldırarak zamandan tasarruf sağlayabilir.
   2. Fareyi% 2-3 izofluran ile uyuşturun, ta ki düzeltme refleksi belirtisi kalmayana kadar. Ayrıca, anestezi durumunu doğrulamak için kuyruk ve/veya pençe kıstırma refleksini kontrol edin.
   3. Kürk başının tüm ventral yüzeyini tıraş edin ve cildi steril tekniğe göre hazırlayın. İşlem sırasında izofluran uygulamasına devam etmek için fareyi bir burun konisi ile stereotaktik aparata yerleştirin; izofluranı% 1.5'e düşürün. Başı sabitlemek için kulak çubuklarını hafifçe sıkın ve farenin gözlerini kapatmak için göz kayganlaştırıcı uygulayın.
   4. Küçük bir cilt kesisi (3 mm) yapın, ardından kafatasını ortaya çıkarmak için alttaki deri altı dokuların künt diseksiyonunu yapın. Hidrojen peroksit ile ıslatılmış pamuk uçlu aplikatör çubukları kullanarak kafatasını kurulayın.
   5. Kafatasında bregmanın 0.5 mm posterior ve 1.1 mm lateralinde bir çapak deliği açın - kafatasında koronal sütürün sagital sütür ile dik olarak kesiştiği anatomik nokta (Şekil 2A) ve ayrıca dura materini ortaya çıkarmak için 0.9 mm'lik bir çapak deliği. Mikromatkabı bir kenara çekin ve bir siyanoakrilat steril yapıştırıcı kullanılarak kafatasına yapıştırılmış bir enjeksiyon portu (yaklaşık 2,5 mm derinlik) yerleştirmeden önce çapak deliğini hemen çevreleyen kemiği nazikçe çizin. Kesintili bir dikiş deseninde veya çanta ipi sütüründe 4-0 emici olmayan naylon sütürler kullanarak enjeksiyon noktası etrafında devlet sütürü.
   6. Ameliyat sonrası fareleri ameliyat iyileşmesi için ayrı kafeslerde barındırın.
      not: Murine Ommaya'nın, muhtemelen sürekli kurcalama etkileşimleri nedeniyle, ameliyatla kurtarılan birden fazla fare aynı kafese yerleştirildiğinde çıkması mümkündür. Murine Ommaya implante edilmiş farelerin, ilaç etkinliği denemesi boyunca ayrı ayrı (veya kafes başına en fazla 2 fare) barındırılması önerilir.

2. Murine Ommaya Tedavisi

1. Murine Ommaya kullanarak farelerin dozlanması
   1. Fareyi% 2-3 izofluran ile uyuşturun, refleksi düzeltme belirtisi kalmayana kadar. Ayrıca, anestezinin sürdürülmesini doğrulamak için kuyruk ve/veya pençe kıstırma refleksini kontrol edin.
   2. Bir port enjeksiyon adaptörü ve bir Hamilton şırınga kullanarak Murine Ommaya'ya erişin. Forseps kullanarak, minyatür enjeksiyon portunun üst kısmını tutun ve port enjektör adaptörünü yavaşça portun septumuna tam olarak yerleştirin.
      not: Port enjektör, ölü alanı en aza indirecek şekilde portun septumunu deler ve motorlu bir şırınga pompası aracılığıyla kontrollü enjeksiyona izin verir (Şekil 3A). Hedefe yönelik / yeni tedaviler anestezi altındayken 1 μL / dk akış hızında enjekte edilir. Tedavi, araştırmacının takdirine bağlı olarak, belirli aralıklarla (günlük/haftalık) belirli bir süre (haftalar/aylar) verilmelidir.
      3 ila 7 μL arasındaki bir hacim optimaldir, çünkü <3 μL'lik bir hacim güvenilmezdir ve >7 μL'lik bir hacim çok fazla basınca neden olabilir. Hamilton şırıngasının boyutu, her bir tedavi kolundaki fare sayısına bağlı olarak 10 ila 100 μL arasında değişebilir. Uygun hacmin Hamilton şırıngaya önceden yüklenmesi, şırınganın tekrar tekrar değiştirilmesini önleyecek ve böylece hataları en aza indirecektir. Tedavi kolu başına 1 Hamilton şırınga ayırmak en iyisidir.
   3. Enjeksiyon yapıldıktan sonra, Murine Ommaya'yı forseps kullanarak port enjeksiyon adaptöründen ayırın ve anesteziden kurtulmak için fareyi kafese geri koyun.

Sonuçlar

Şekil 1: Farelerde Murine Ommaya implantasyonunu gerçekleştirmek için bir iş istasyonu kurulumu örneği. (1) Gaz anestezi makinesi/buharlaştırıcı. (2) Stereotaksik bir standı kaplayan steril mavi kağıt örtü. (3) Stereotaksik cihaz (stand / sahne, kulak çubukları, burun konisi). (4) Mikro matkap. (5) Işıklı büyüteç. (6) Steril tuzlu su durulama kabı ile steril pamuk uçlu aplikatör çubukları. (7) Hidrojen peroksit. (8) Boncuk sterilizatörü.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mm ara disk	Alzet, Dürect Şirketi	#0008670	Yalnızca ara disk
4-0 Etilon Naylon Sütür	Herhangi bir satıcı
Otomatik şırınga pompaları	Harvard Şırınga Pompaları (veya herhangi bir satıcı)	# 70-4505	Pompa 11 Elit
Boncuk sterilizatörü	Braintree Scientific Inc. (veya herhangi bir satıcı)	#GER 5287-120V	Çimlendirici 500
Buprenorfin Sürekli Salımı (Bup-SR)	Hayvanat bahçesi		DEA kontrollü
Siyanoakrilat steril yapıştırıcı	Herhangi bir satıcı
Gaz inhalasyon anestezi sistemi	VeteEquip (Donanım)	#901812	COMPAC5
Hamilton mikrolitre şırıngalar	Hamilton		10, 25, 50 ve 100 μL; Cisterna magna enjeksiyonu için 30G
Hidrojen peroksit	Herhangi bir satıcı
IVIS 200 görüntüleme sistemi	Kumpas Yaşam Bilimleri
Işıklı büyüteç	Herhangi bir satıcı
Mikro matkap	Hırsızlık (veya herhangi bir satıcı)	#51555M
MRG görüntüleme	Bruker	BioSpec serisi	opsiyonel
Murine Ommaya (MRI uyumlu) prototipi	Instech Laboratuvarları A.Ş.	#VAB620-25MRG-3.3
PinPort enjektör	Instech Laboratuvarları A.Ş.	#PNP3M-50
Pin Bağlantı Noktası	Instech Laboratuvarları A.Ş.	#1-PNP3F28-50
Kemirgen Cerrahi Aletleri (Makas, Forseps)	Roboz Cerrahi Alet (veya herhangi bir satıcı)
Stereotaksik cihaz	Hırsızlık (veya herhangi bir satıcı)	#51730M
Steril mavi kağıt/örtü kaplama	Herhangi bir satıcı
Steril pamuklu çubuklar	Herhangi bir satıcı