Hücresel Biyolüminesans Tabanlı Test: Kombinatoryal İlaç Taraması için Yüksek Verimli Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Hu, Z. et al. Hastadan Elde Edilen Glioma Kök Hücrelerini Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Bir Tarama İş Akışı.J. Vis. Uzm.(2021)

Bu videoda, ilaçların hassas ve hızlı taranması için biyolüminesans testinin faydasını vurgulayan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu ilaçlar, etki şekillerindeki sinerjizmi değerlendirmek için tek başına veya kombinasyon halinde test edilebilir.

Protocol

1. Hücre Canlılığının Biyolüminesans Tabanlı Ölçümü

1. Plakaları hücre dışı matris (ECM) karışımı ile kaplama (örneğin, Matrigel): Her oyuka 40 μL 0.15 mg / mL ECM karışımı ekleyin ve plakayı 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Fazla ECM karışımını çıkarın ve PBS ile bir kez nazikçe durulayın.
2. 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 ve 500 XG387-Luc hücresi içeren 100 μL kültür ortamı ile birlikte 100 μL boş ortam ekleyin, her bir oyuğa kontrol olarak 96 oyuklu bir optik alt plakada 6 kopya için ekleyin ve hücreleri gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.
3. Süpernatanı çıkarın, her bir oyuğa 150 ng / μL D-lusiferin içeren 50 μL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
4. IVIS spektrum görüntüleme sistemini kullanarak plakadaki hücresel biyolüminesansın görüntülerini alın. İlgilenilen bölgenin (ROI) birden fazla dairesel alanını oluşturmak ve hücresel biyo-lüminesansı ölçmek için yerleşik yazılımı kullanın.

2. Temozolomid Tedavisi ve Kombinasyon Taraması

1. İşlemden önce, yukarıda 1. adımda açıklandığı gibi dört adet 96 oyuklu plakayı önceden kaplayın.
2. XG387-Luc hücrelerini, 100 μL kültür ortamında 1.000 hücre yoğunluğunda, 96 oyuklu bir optik alt plakanın her bir oyuğuna tohumlayın ve hücreleri gece boyunca kültürleyin.
3. Temozolomid ve hedeflenen ajanları stok çözeltisinden önceden hazırlayın. Tek ajan tedavisi için kültür ortamında 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM ve 50 μM temozolomidden oluşan bir konsantrasyon serisi hazırlayın. Kombinasyon ilaç taraması için 200 μM ve 2 μM'lik nihai konsantrasyonları elde etmek için temozolomid ve hedeflenen ajanları sırasıyla kültür ortamında stok çözeltisinde seyreltin (Malzeme listesi).
4. GSC'lerin çoğu plakaların dibine yapıştığında kültür ortamını çıkarın; tedavi başına üç teknik kopya için her bir oyuklu içine temozolomid içeren yukarıda hazırlanmış ortamı ekleyin.
5. Temozolomidi tedavi etmek ve ilaç kombinasyonlarını taramak için boş ortamı çıkarın ve 200 μM temozolomid veya 2 μM hedefli ajan veya her ikisinin bir kombinasyonunu içeren yukarıda hazırlanmış ortamı, tedavi başına üç teknik kopya için her bir oyuğa ekleyin.
6. Tüm plakaları 3 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
7. İlaç içeren ortamı çıkarın, her bir oyuğa 150 ng / μL D-lusiferin içeren 50 μL boş ortam ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
8. IVIS spektrum görüntüleme sistemini kullanarak plakadaki hücresel biyolüminesansın görüntülerini alın. Birden fazla döngüsel ROI oluşturmak ve hücresel biyolüminesansı ölçmek için yerleşik yazılımı kullanın.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 Uzay Aracı	Gibco (Gibco)	17504-044	50 katı
EGF (Türkçe)	Gibco (Gibco)	PHG0313	20 ng/ml
Kadın Sünneti	Gibco (Gibco)	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Maks	Gibco (Gibco)	35050061	100 kat
Nörobazal	Gibco (Gibco)	21103049	1 katı
Penisilin-Streptomisin	HyClone (Klon	SV30010	P: 10.000 birim / ml S: 10.000 ug / ml
Sodyum Pirüvat	Gibco (Gibco)	2088876	100 milyon
ABT-737	MCE (Girişimci		Seçici ve BH3 mimetik Bcl-2, Bcl-xL ve Bclw inhibitörü
Adavosertib (MK-1775)	MCE (Girişimci		Wee1 inhibitörü
Axitinib Belediyesi	MCE (Girişimci		Çok hedefli tirozin kinaz inhibitörü
AZD5991	MCE (Girişimci		Mcl-1 inhibitörü
Bir 83-01	MCE (Girişimci		TGF-β tip I reseptör ALK5 kinazın güçlü inhibitörü
CGP57380	Selleck Belediyesi		Güçlü MNK1 inhibitörü
Daktolisib (BEZ235)	Selleck Belediyesi		Çift ATPrekabetçi PI3K ve mTOR inhibitörü
Dasatinib Belediyesi	MCE (Girişimci		Çift Bcr-Abl ve Src ailesi tirozin kinaz inhibitörü
Erlotinib (Erlotinib Çiçeği)	MCE (Girişimci		EGFR tirozin kinaz inhibitörü
Gefitinib	MCE (Girişimci		EGFR tirozin kinaz inhibitörü
Linifanib Belediyesi	MCE (Girişimci		VEGFR ve PDGFR ailesinin çok hedefli inhibitörü
Masitinib	MCE (Girişimci		c-Kit inhibitörü
ML141	Selleck Belediyesi		Cdc42 GTPase'in rekabetçi olmayan inhibitörü
OSI-930	MCE (Girişimci		Kit, KDR ve CSF-1R'nin çok hedefli inhibitörü
Palbociclib (Palbociclib)	MCE (Girişimci		Seçici CDK4 ve CDK6 inhibitörü
SB 202190	MCE (Girişimci		Seçici p38 MAP kinaz inhibitörü
Sepantronyum bromür (YM-155)	MCE (Girişimci		Hayatta kalma inhibitörü
TCS 359	Selleck Belediyesi		Güçlü FLT3 inhibitörü
UMI-77	MCE (Girişimci		Seçici Mcl-1 inhibitörü
4-Hidroksitamoksifen (Afimoksifen)	Selleck Belediyesi		Seçici östrojen reseptörü (ER) modülatörü