Mikroglia Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin SEC Tabanlı İzolasyonu: Mikroglia Şartlandırılmış Kültür Ortamından Hücre Dışı Vezikülleri İzole Etme Tekniği

Abstract

Kaynak: Lemaire, Q. et al. İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Ortamı Üzerindeki Fonksiyonel Etkinin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, beyin bağışıklık hücrelerinden (mikroglia) türetilen hücre dışı vezikülleri veya EV'leri izole etmek için boyut dışlama kromatografisine (SEC) dayalı bir yöntem açıklanmaktadır. EV'ler, bir bağışıklık tepkisini düzenleyen aracıları iletmek için moleküler kargo görevi görür. Bu nedenle, izole edilmiş EV'ler, bir nöronal bağışıklık tepkisi sırasında mikroglia-nöron karışmasını incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Protocol

1. Mikroglia/Makrofajların Birincil Kültürü

1. Birincil mikroglia kültürü
   1. % 10 eksozom içermeyen serum, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 37 ° C'de% 5 CO₂'de 9.0 g / L glikoz ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) kültür ticari sıçan birincil mikroglia (2 x 10⁶ hücreli) (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. 48 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EV'lerin izolasyonuna devam edin.
2. Makrofajların birincil kültürü
   1. Ticari sıçan birincil makrofajlarını (1 x 10⁶ hücreli) üretici tarafından sağlanan ortamda (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C ve% 5 CO_2'de, eksozom içermeyen serum ile kültürleyin.
   2. 24 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EV'lerin izolasyonuna devam edin.

2. EV'lerin İzolasyonu

1. EV'lerin şartlandırılmış ortamdan ön izolasyonu
   1. Şartlandırılmış kültür ortamını mikroglia veya makrofaj kültürlerinden (adım 1.1.2 veya 1.2.2) konik bir tüpe aktarın.
   2. Hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı yeni bir konik tüpe aktarın. Apoptotik cisimleri ortadan kaldırmak için RT'de 20 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı 10.4 mL'lik bir polikarbonat tüpe aktarın ve tüpü 70.1 Ti'lik bir rotora aktarın. EV'leri peletlemek için 4 ° C'de 90 dakika boyunca 100.000 x g'da ultrasantrifüj edin.
   5. Süpernatanı atın ve 200 μL 0.20 μm filtrelenmiş fosfat tampon salin (PBS) içinde EV içeren peleti yeniden süspanse edin.
2. EV'lerin İzolasyonu
   1. Ev yapımı boyut dışlama kromatografi kolonunun (SEC) hazırlanması
      1. Bir cam kromatografi kolonunu boşaltın (uzunluk: 26 cm; çap: 0,6 cm) (Malzeme Tablosuna bakınız), yıkayın ve sterilize edin.
      2. Sütunun altına 60 μm'lik bir filtre yerleştirin.
      3. 0,6 cm çapında ve 20 cm yüksekliğinde sabit bir faz oluşturmak için sütunu çapraz bağlı bir agaroz jel filtrasyon taban matrisi ile istifleyin.
      4. Fazı 50 mL 0.20 μm filtrelenmiş PBS ile durulayın. Gerektiğinde daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
   2. Yeniden askıya alınmış EV peletini SEC kolonunun sabit fazının üzerine yerleştirin.
   3. Kolonun kurumasını önlemek için sabit fazın üstüne 0,20 μm filtrelenmiş PBS eklemeye devam ederken 250 μL'lik 20 ardışık fraksiyon toplayın. Gerekirse fraksiyonları -20 °C'de saklayın.
      not: Moleküler analiz için EV bütünlüğünü korumak için -80 °C'de bir haftadan daha uzun bir depolama gerçekleştirilebilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sıçan Makrofaj ve Mikroglia Kültür Besiyeri	Hücre Uygulamaları	R620K-100	Hücre orjini: Normal sağlıklı Rat kemik iliği
Sıçan birincil mikroglia	Fransa	RG535
Sefaroz CL-2B	GE Sağlık	17014001
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	A95765
Ultrasantrifüj Rotor 70.1 Ti	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	342184
glikoz	Sigma-Aldrich	G8769
Fosfat Tampon Salin	Canlandırıcı	14190094	Kalsiyum yok, magnezyum yok
Polikarbonat santrifüj tüpleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	355651
Penisilin-Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122
Exo-FBS (Dış-FBS)	Özyme	EXO-FBS-50A-1	Eksozom tükenmiş FBS
DMEM Gibco 41966029
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5804000010
CO2 İnkübatörü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
pluriSüzgeç M/ 60 μm	çoğul seçimi	43-50060
MonoP FPLC sütunu	GE Sağlık		Artık mevcut değil