Hücre Dışı Veziküllerle İlişkili Proteinlerin SDS-PAGE Tabanlı Ekstraksiyonu: EV'lerden Proteinleri Ekstrakte Etme ve Bunları Jel İçi Sindirime Hazırlama Prosedürü

Özet

Kaynak: Lemaire, Q. et al. İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Ortamı Üzerindeki Fonksiyonel Etkinin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, hücre dışı veziküllerden veya EV'lerden protein ekstraksiyonu için SDS-PAGE jel içi sindirim yöntemini gösteriyoruz. İzole edildikten sonra, elde edilen protein parçaları proteomik analiz için kullanılabilir.

Protokol

1. EV'lerin karakterizasyonu

1. Western Blot Analizi
   1. Protein ekstraksiyonu
      1. EV'leri boyut dışlama kromatografi kolonuna (SEC) göre izole edin ve nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak nicelik belirleyin.
      2. 50 μL RIPA tamponunu (150 mM sodyum klorür [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N', N', tetraasetik asit [EGTA], 2 mM Etilendiamin-tetraasetik asit [EDTA], 100 mM sodyum florür [NaF], 10 mM sodyum pirofosfat,% 1 Nonidet P-40, 1 mM Fenilmetansülfonil florür [PMSF], 1x proteaz inhibitörü) EV numunesi ile karıştırın (filtredeki EV konsantrasyonundan kaynaklanan 25 μL) buz üzerinde 5 dakika boyunca proteinleri çıkarın.
      3. 5 saniye boyunca sonikat (genlik: 500 W; frekans: 20 kHz), buz üzerinde 3 kez.
      4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile veziküler kalıntıları temizleyin.
      5. Süpernatanı toplayın ve Bradford protein tahlil yöntemi ile protein konsantrasyonunu ölçün.
   2. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve western blotlama
      1. Protein ekstraktlarını (30 μg) 5c Laemmli numune tamponu (h/h) ile karıştırın.
      2. Protein karışımını %12'lik bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin.
      3. Jeldeki proteinleri TGS tamponu (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM Glisin ve% 0.1 SDS) ile 70 V'ta 15 dakika ve 120 V'ta 45 dakika boyunca geçirin.
      4. Proteinleri 30 dakika boyunca 230 V'ta yarı kuru sistemli bir nitroselüloz membrana aktarın.
      5. Membranı bloke edici tampon ile RT'de 1 saat doyurun (% 0.05 Tween 20 w / v, 0.1 M PBS'de% 5 süt tozu, pH 7.4).
      6. Membranı, bloke edici tampon (1:100) içinde seyreltilmiş fare monoklonal anti-insan ısı şoku proteini 90 (HSP90) antikoru ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      7. Membranı PBS-Tween (PBS, %0,05 Tween 20 w/v) ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.
      8. Bloke edici tampon (1: 10.000) içinde seyreltilmiş keçi, yaban turpu, peroksidaz konjuge anti-fare IgG ikincil antikoru ile zarı RT'de 1 saat inkübe edin.
         NOT: Negatif kontrol, tek başına ikincil antikor kullanılarak gerçekleştirilir.
      9. Yıkama adımını tekrarlayın (adım 1.1.2.7).
      10. Membranı gelişmiş kemilüminesans (ECL) batı lekeleme substrat kiti ile ortaya çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız).

2. Proteomik Analiz

1. Protein ekstraksiyonu ve jel içi sindirim
   1. EV'leri boyut dışlama kromatografi kolonuna (SEC) göre izole edin ve nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak nicelik belirleyin. EV protein ekstraksiyonu için adım 1.1.1'i tekrarlayın.
   2. % 12'lik bir poliakrilamid jelin istifleme jelinde protein göçü gerçekleştirin.
   3. RT'de 20 dakika boyunca Coomassie mavisi ile jeldeki proteinleri sabitleyin.
   4. Her renkli jel parçasını kesin ve 1 mm'lik küçük parçalar halinde kesin³.
   5. Jel parçalarını her solüsyondan 300 μL ile art arda yıkayın: 15 dakika ultra saf su, 15 dakika boyunca %100 asetonitril (ACN), 15 dakika boyunca 100 mM amonyum bikarbonat (NH₄HCO₃), ACN: 100 mM NH₄HCO₃ (1: 1, v / v) 15 dakika ve sürekli karıştırarak 5 dakika boyunca% 100 ACN.
   6. Tamamen jel parçalarını bir vakum konsantratörü ile kurutun.
   7. 56 ° C'de 1 saat boyunca 10 mM ditiyotreitol içeren 100 μL 100 mM NH₄HCO₃ ile protein azaltma gerçekleştirin.
   8. RT'de karanlıkta 45 dakika boyunca 50 mM iyodoasetamid içeren 100 μL 100 mM NH_4HCO3 ile protein alkilasyonu gerçekleştirin.
   9. Jel parçalarını her solüsyondan 300 μL ile art arda yıkayın: 100 mM_NH4HCO₃ 15 dakika, ACN: 20 mM NH₄HCO₃ (1: 1, v / v) 15 dakika ve sürekli karıştırma ile 5 dakika boyunca% 100 ACN.
   10. Jel parçalarını bir vakum yoğunlaştırıcı ile tamamen kurulayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetonitril	Fisher Kimyasalları	A955-1
Amonyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β antikoru (RRID: AB_675659)	Noel Baba	SC-13119
Bio-Rad Protein Testi Boya Reaktif Konsantresi (Bradford)	Biyo-Rad	5000006
Ditiyotreitol	Sigma-Aldrich	43819
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N', N', N'- tetraasetik asit	Sigma-Aldrich	03777-10G
Etilendiamintetraasetik asit	Sigma-Aldrich	ED-100G
Fisherbrand Q500 Problu Sonikatör	Balıkçı markası	12893543
İdoasetamid	Sigma-Aldrich	I1149 Serisi
InstantBlue Coomassie Protein Lekesi	Deneyim	ISB1L
Laemmli 2x	Biyo-Rad	1610737
Nonidet P-40	Fluka Çiçeği	56741
Peroksidaz AffiniSaf Keçi AntiMouse IgG (H+L)	Jackson İmmün Araştırma	115-035-003
Phalloidin-tetrametilrodamin konjugatı	Noel Baba	SC-362065
Proteaz İnhibitörü	Sigma-Aldrich	S8830-20SEKME
Sodyum Klorür	Scharlau Belediyesi	SO0227
Sodyum Dodesil Sülfat	Sigma-Aldrich	L3771
Sodyum Florür	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Sodyum pirofosfat	Sigma-Aldrich	S6422-100G
SpeedVac Vakum Konsantratörü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer hücresi	Biyo-Rad	1703940