$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İntravital Görüntüleme
NOT: Tümör hücresi enjeksiyonu ile ilk intravital görüntüleme seansı arasındaki zaman aralığı, kullanılan tümör hücresi hattının tipine bağlıdır. Bu protokolde gösterilen deneyler için 1x 105 GL261 hücresi enjekte edildi ve 10 gün sonra görüntülendi.
- Görüntüleme hazırlığı
- Bir yüz maskesi (% 1.5 -% 2 izofluran / O2 karışımı) aracılığıyla izofluran inhalasyon anestezisi kullanarak fareyi sakinleştirin.
- Dehidrasyonu önlemek için fareye deri altına 100 μL tuzlu su tamponu enjekte edin.
not: Uzun süreli görüntüleme için, fare bir deri altı infüzyon pompası ile hidratlanabilir.
- Fareyi yüzü yukarı bakacak şekilde bir görüntüleme kutusuna yerleştirin. CIW'nin görüntüleme kutusuna sabitlenmesini sağlamak için 1 mm çapında bir deliğe ve açıklığın etrafına gömülü küçük mıknatıslara sahip metal bir plaka kullanın. İzofluranı bir yüz maskesinden geçirin ve kutunun diğer tarafındaki bir çıkıştan havalandırın (% 0.8 -% 1.5 izofluran / O2 karışımı). İsteğe bağlı olarak, farenin gövdesini sabitlemek için bant kullanın.
not: Kan damarı görselleştirme için floresan etiketli dekstran veya diğer boyalar bu noktada intravenöz olarak enjekte edilebilir.
- İsteğe bağlı olarak, musun hayati değerlerini izlemek için bir nabız oksimetresi ve bir ısıtma probu kullanın.
not: Bu deneyde, fare görüntüleme süresi boyunca (2-3 saat) stabil olduğu için bir nabız oksimetresi ve bir ısıtma probu kullanmak gerekli değildi. Bununla birlikte, daha uzun görüntüleme süreleri için daha kapsamlı izleme gerekebilir.
- 25x (örneğin, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) su hedefini en düşük z konumuna ayarlayın ve büyük bir damla su ekleyin.
not: Suya daldırma mikrodispenserinin kullanılması, bilim adamlarının deney sırasında su eklemesine izin verdiği için uzun süreli deneyler için şiddetle tavsiye edilir. Alternatif olarak, kuru bir objektif kullanılabilir.
- Görüntüleme kutusunu, 37 °C'de tutulan karanlık bir iklim odası ile donatılmış mikroskoba aktarın. Objektifi, su damlası ona değene kadar CIW lamel üzerine getirin.
- Epifloresan modunu kullanarak, tümörü göz merceğinden gözlemleyin ve hücreleri odak noktasına getirin.
2. Zaman atlamalı görüntü alımı
- Yazılımda koordinatlarını görüntülemek ve kaydetmek için birkaç ilgi çekici konum seçin. Seçilen pozisyonların tümörün farklı bölgelerinden temsili pozisyonlar olduğundan emin olun (her tümör farklı olabilir, ancak tutarlılığı sağlamak için, tüm farelerde tümör çekirdeğinin merkezinde ve kenarlarda bulunan aynı miktarda pozisyon seçin).
not: Tümörün bir kısmının veya görünür tümörün tamamının karo taraması yapılabilir; Bununla birlikte, tümör büyükse, bu yöntem görüntüler arasındaki zaman atlamasını artıracaktır. Ek olarak, tümör hücreleri hızlı hareket ederse, zaman içinde aynı hücreleri izlemek zor olabilir.
- Çoklu foton moduna geçin ve lazeri doğru dalga boyuna ayarlayın. Fotohasarı önlemek için daha yüksek dalga boylarının istendiğini unutmayın.
not: Dendra2 görüntüleme için 960 nm dalga boyu kullanıldı. Bu deneylerde kullanılan objektifle, tümör çekirdeğinin iyi bir çözünürlüğünü elde etmek ve tümörün temsili bir alanını taramak için 1.3'lük bir yakınlaştırma yeterliydi.
- Tümör hücresi çözünürlüğünden ödün vermeden maksimum tümör hücresi hacmini elde etmek için canlı moda gidin ve her pozisyon için bir z-yığını tanımlayın. Görüntüler arasındaki adım boyutunu 3 μm olarak tanımlayın.
- Tarama hızını artırmak için çift yönlü modu kullanın. Görüntü çözünürlüğü en az 512 x 512 piksel olmalıdır.
- 2 saat boyunca her 20 dakikada bir farklı pozisyonlarda tümör hacminin görüntülerini elde edin. Her görüntü alımından önce objektife su ekleyin.
not: Hızlandırılmış görüntüler, yazılımda doğru zaman atlamalı ayarlanarak otomatik olarak elde edilebilir. Ancak, fare hareket edebilir ve konum veya z yığını zamanla kayarak veri kaybına neden olabilir. Bu nedenle, hızlandırılmış çekimin manuel olarak gerçekleştirilmesi ve alımlar arasındaki xyz kaymalarının kontrol edilmesi ve ayarlanması önerilir.
- Bu adımda, isteğe bağlı olarak, Dendra2 floresan kalemi fotoğrafla değiştirin.
not: Hızlandırılmış görüntülemenin aksine (tek tek tümör hücrelerinin özelliklerini ve zaman içinde nasıl değiştiklerini incelemeye izin verir), bu, beyindeki tümör hücresi infiltrasyonu alanının birkaç gün boyunca incelenmesine izin verecektir.