1. İn Vitro Makrofaj Çekim Testi
- Şartlandırılmış ortamların hazırlanması
- Tümör hücresi bakım ortamını 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 dakika ısıtın.
- Doku kültürü davlumbazının yüzeyine %70 etanol püskürtün ve yüzeydeki %70 etanolü kağıt havluyla silin. Hücre ayırma solüsyonunu buzdolabından alın. Ortamın şişelerine ve hücre ayırma solüsyonuna% 70 etanol püskürtün, yüzeydeki% 70 etanolü kağıt havluyla silin ve doku kültürü kapağına getirin.
- 6 oyuklu plakaları inkübatörden çıkarın. Şartlandırılmış ortamı dikkatlice 15 mL steril santrifüj tüplerine pipetleyin. Tüpleri buzun üzerine koyun. Ortamı "yalnızca ortamda" ayrı bir 15 mL steril santrifüj tüpüne iyice pipetleyin.
NOT: Bu adımdan önce, hücrelerin yapışıp yapışmadığını görmek için mikroskop altında kontrol ettiğinizden emin olun. Aksi takdirde, daha iyi bağlantıya izin vermek için kaplanmış plakalar kullanılabilir veya yüzen hücreler sayma adımına dahil edilebilir.
- 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 0,5 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Tümör hücrelerinin her dakika yuvarlanıp yuvarlanmadığını kontrol edin. Tümör hücreleri toplandıktan sonra, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun.
- 2.5 mL tümör hücresi bakım ortamını kuyuya pipetleyin, hücreleri karıştırmak ve 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarmak için 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 10 μL hücre alın ve 10 μL Tripan Mavisi çözeltisi ile karıştırın. Karışımın 10 μL'sini sayma sürgününe pipetleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı hücrelerin sayısını ölçün.
- Serum içermeyen kök hücre ortamını kullanarak şartlandırılmış ortamın hacmini hücre sayısına göre ayarlayın (gece boyunca 37 ° C inkübasyon). Örneğin, Kuyu A, en az hücre sayısına sahip kuyudan 3 kat daha fazla canlı hücreye sahipse, şartlandırılmış ortamını 1:3 oranında seyreltin. Bu adım, hücre çoğalma hızının neden olduğu farkı kontrol etmek için kullanılır.
not: Gece boyunca 37 °C inkübasyon ile serumsuz kök hücre ortamının kullanılmasının nedeni, uzun süreli 37 °C maruziyet ile ortamdaki olası değişikliği kontrol etmektir.
- Şartlandırılmış ortamı 0,45 μm filtrelerden geçirin. Şartlandırılmış ortamı buzun üzerine koyun.
NOT: Bu adım, şartlandırılmış ortamdaki hücreleri ve hücre kalıntılarını temizler.
2. MV-4-11 Hücrelerinin Hazırlanması
- IMDM ortamını (FBS olmadan) 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 dakika ısıtın.
- Doku kültürü davlumbazının yüzeyine %70 etanol püskürtün ve yüzeydeki %70 etanolü kağıt havluyla silin. Orta boy şişeye %70 etanol püskürtün, yüzeydeki %70 etanolü kağıt havluyla silin ve doku kültürü başlığına getirin.
- MV-4-11 hücrelerinin şişesini doku kültürü başlığına alın. 10 mL hücreleri 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne pipetleyin. 10 μL hücre alın ve 10 μL Tripan Mavisi çözeltisi ile karıştırın. Karışımın 10 μL'sini sayma sürgününe pipetleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı hücrelerin sayısını ölçün. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
- Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri 200 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
- 1x106 hücre / mL.
nihai hücre yoğunluğu için hücreleri IMDM ortamında (FBS olmadan) yeniden süspanse edin
NOT: Burada kullanılan makrofajların hücre sayısı ayarlanabilir.
3. Transwell Testi
>NOT: Bu adım için bir hücre migrasyon test kiti kullanın veya reaktifleri satın alın ve ayrı olarak yerleştirin. MV-4-11 hücreleri için 5 μm gözenek boyutuna sahip Transwell kesici uçları seçin. Makrofaj göçünü tespit etmek için, alt odadaki makrofaj sayısını doğrudan ölçün veya kolorimetrik/florimetrik yöntemler kullanın. Burada, kolorimetrik yöntemi kullanarak testi gösteriyoruz.
- 24 oyuklu plakayı, eki ve reaktifleri oda sıcaklığına getirin.
- Her bir inserte yukarıda hazırlanan 250 μL MV-4-11 hücresi ekleyin.
- 24 oyuklu plakanın alt odalarına sadece 400 μL şartlandırılmış ortam/ortam ekleyin (37 ° C'de gece boyunca inkübasyon ile, bu numuneler negatif kontrol görevi görür). Her tümör hattı veya kontrolü için üçlü örnekler kullanın. Ek parça ile şartlandırılmış ortam arasında kabarcık oluşmasını önleyin. Kabarcıklar, makrofajların dip kuyularına göç etmesini engelleyecektir.
- Plakaları 37 °C'lik bir inkübatörde 4 h.
için %5 CO2 ile inkübe edin
NOT: Kuluçka süresi ayarlanabilir. Alt odacıklara göç eden hücreler mikroskop altında görülebilir.
- Aynı kuyunun iç duvarındaki ek parçaya hafifçe vurun ve ek parçayı atın. MV-4-11 hücreleri süspansiyon halinde büyüdükçe, burada hücre ayırma çözeltisi veya tripsin tedavisine gerek yoktur.
- Karıştırmak için kuyucuklardaki hücreleri 3 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. 225 μL hücre süspansiyonunu floresan ölçümü için uygun siyah duvarlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
- CyQuant boyasını 1:75 oranında 4x lizis tamponu ile seyreltin. Kısa bir süre girdap yapın ve çözeltiyi aşağı doğru döndürün. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 75 μL çözelti ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Floresan plaka okuyuculu 480/520 nm filtre setini kullanarak floresan okuyun.
- Boşluğu çıkararak ve kontrol tümör hücresi hattına normalleştirerek verileri analiz edin.
