Hücre Dışı Vezikül Ekstraksiyonu: Diferansiyel Santrifüjleme Kullanarak Tüm Doku Örneklerinden Hücre Dışı Vezikülleri İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Hurwitz, S. N. et al. Tüm Dokudan Hücre Dışı Veziküllerin Ekstraksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, taze veya donmuş dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması tekniği açıklanmaktadır. İzole edilen hücre dışı veziküller, hastalık patogenezindeki önemli rollerini ortaya çıkarmak için daha ileri analizler için kullanılabilir.

Protokol

1. Doku Ayrışması ve Diferansiyel Santrifüjleme

1. Hibernate-E ortamında yaklaşık 0.4–1.0 g doku için 10 mL ayrışma tamponu (10 mg papain; 5.5 mM L-sistein; 67 μM 2-merkaptoetanol; 1.1 mM EDTA) hazırlayın.
   NOT: EV zenginleştirme ve saflaştırma için kullanılan tüm çözeltiler ultra saf filtrelenmiş suda seyreltilmelidir.
2. 50 mL'lik konik bir tüpte ayrışma tamponuna bütün taze veya donmuş dokuyu ekleyin ve 37 ° C'de ılık su banyosunda 20 dakika inkübe edin. Gerekirse doku inkübasyondan önce daha küçük parçalar halinde kesilebilir.
3. İnkübasyonun ardından, dokuyu içeren ayrışma tamponuna son 1x konsantrasyon için proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin.
4. Dokuyu içeren solüsyonu gevşek oturan bir Dounce homojenizatöre dökün ve numune başına yaklaşık 30 yavaş vuruş kullanarak dokuyu nazikçe ayırın. Vuruş sayısı doku kıvamına göre ayarlanabilir.
5. Ayrışmış dokuyu tampon içinde 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri ve kalan fibröz veya kohezif doku parçalarını peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
6. Süpernatanı temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın ve büyük hücresel kalıntıları pelet yapmak ve atmak için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı tekrar temiz 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve istenmeyen daha büyük vezikülleri veya küçük apoptotik cisimleri peletlemek için 4 ° C'de 40 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Bu pelet, istenirse daha büyük veziküllerin ek çalışması için saklanabilir.
8. Süpernatanı 0,45 μm'lik bir filtreden temiz bir 12 mL ultrasantrifüj tüpüne boşaltın.
   not: Yoğun fibrotik doku örnekleri kolayca filtrelenemeyebilir. Bu numuneler 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzülebilir, daha sonra 0,45 μm'lik filtreden süzülmeden önce seri olarak daha küçük iğnelerden (18 G, 20 G, 22 G) geçirilebilir.
9. Küçük EV'leri peletlemek için numuneyi 4 °C'de 2 saat boyunca 100.000 x g'da ultrasantrifüjleyin.
10. Süpernatanı boşaltın ve ultrasantrifüj tüplerini 5-10 dakika ters çevrilmiş halde bırakın, tüplerin yanlarında kalan sıvıyı çıkarmak için sık sık hafifçe vurun. Artık sıvı, aspirasyonlu bir vakum pipeti kullanılarak da aspire edilebilir.
11. EV peletini 1.5 mL 0.25 M sükroz tamponunda (10 mM Tris, pH 7.4) yeniden süspanse edin. Bu adımda peletin tamamen yeniden süspansiyonunu sağlamak önemlidir. Bunu yapmak için, EV'leri çözeltiye girdaplamadan önce tüpleri parafilm ile kaplayın. Son bir girdap karışımından önce ultrasantrifüj tüplerini oda sıcaklığında 15-20 dakika sallayın.
12. Tüpün altındaki sıvı süspansiyonu geri kazanmak için tüpleri 1.000 x g'dan fazla olmayan bir hızda kısaca santrifüjleyin.
13. Aşağıdaki gradyan saflaştırma adımlarına geçin veya gerekirse EV süspansiyonunu gece boyunca 4 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,45 μm filtre	VWR (VWR)	28145-505
12 mL ultrasantrifüj tüpleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	331372
5.5 mL ultrasantrifüj tüpleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	344057
HALT fosfataz inhibitörü (100x çözelti)	ThermoFisher Bilimsel	78420
HALT proteaz inhibitörü (100x çözelti)	ThermoFisher Bilimsel	78438
Hazırda Bekletme E ortamı	ThermoFisher Bilimsel	A1247601
MLS-50 sallanan kova rotoru	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	367280
Optima MAX-XP Masaüstü Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	393315