Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarının Saflaştırılması: Yoğunluk Gradyanlı Ultrasantrifüjleme Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarını Saflaştırma Tekniği

Özet

Kaynak: Urwitz, S. N. et al. Tüm Dokudan Hücre Dışı Veziküllerin Ekstraksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, karakterizasyon çalışmaları için uygun hücre dışı veziküllerin alt popülasyonlarını izole etmek için yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme tabanlı saflaştırma yöntemini göstermektedir.

Protokol

1. Yoğunluk Gradyan Saflaştırma

1. % 30 iyodiksanol içeren nihai bir çözelti oluşturmak için EV'leri içeren 1.5 mL sükroz / Tris tamponuna 1.5 mL %60 iyodiksanol (su içinde stok çözeltisi) ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   not: Yüksek iyodiksanol konsantrasyonu oldukça viskoz olduğundan, pipet ucundaki çözeltiyi kaybetmemek için dikkatli olun.
2. EV'ler içeren% 30 iyodiksanol tampon çözeltisini 5.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünün dibine aktarın.
3. % 60 iyodiksanol stok çözeltisinden ultra saf suda numune başına en az 1.5 mL %20 ve %10 iyodiksanol çözeltisi hazırlayın.
4. 1.3 mL% 20 iyodiksanol ölçün ve bir şırınga ve 18 G'lik bir iğne kullanarak alt gradyan katmanının üzerine dikkatlice katmanlayın. Yoğunluk arayüzünde katmanların karışmasını önlemek için, iğnenin eğimini menisküsün hemen üzerindeki ultrasantrifüj tüpünün içi ile temas halinde tutun ve çözeltiyi damla damla ekleyin.
5. Yukarıdakiyle aynı tekniği kullanarak% 20 iyodiksanol tabakasının üzerine 1.2 mL% 10 iyodiksanol çözeltisi katmanı.
6. Ultrasantrifüj tüplerini dikkatlice dengeleyin ve rotor kovalarına yükleyin ve 4 °C'de 50 dakika boyunca 268.000 x g'da bir döner kova rotorunda santrifüjleyin. Yoğunluk katmanlarının bozulmasını önlemek için santrifüjün hızlanma ve yavaşlama hızlarını izin verilen minimum oranlara ayarlayın.
7. Her numune için on adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü, yoğunluk gradyanlarının 1 ila 10 arasındaki fraksiyonlarına karşılık gelecek şekilde etiketleyin. Kesir 1, ilk kaldırılacak en üst kesir olarak belirlenirken, kesir 10, en son kaldırılan alt kesirdir.
8. Gradyan ultrasantrifüjleme tamamlandıktan sonra, tüpleri rotor kovalarından yavaşça çıkarın ve sabit bir tutucuya yerleştirin. İlgilenilen fraksiyonda genellikle görünür bir vezikül bandı görülecektir. Degradenin üstünden 490 μL'lik on seri fraksiyonu karşılık gelen tüplere pipetleyin. Tüpün dibinde muhtemelen kirletici proteinler içeren az miktarda sıvı kalacaktır. Bu numune, istenirse 11. kısım olarak atılabilir veya saklanabilir.
9. Bir refraktometre kullanarak fraksiyonların kırılma indekslerini ölçün. Bu, numune koruma gerekliyse paralel olarak çalıştırılan bir kontrol gradyanı ile de gerçekleştirilebilir. İodiksanol içeren her fraksiyondan 20-30 μL'yi refraktometre yüzeyine pipetleyin ve kırılma indekslerini bilinen iyodiksanol yoğunluklarıyla karşılaştırarak yoğunluğu tahmin edin.
   not: Fraksiyonlar, bir sonraki ultrasantrifüj yıkama adımına geçmeden önce gerekirse iyodiksanol içeren çözelti içinde gece boyunca saklanabilir.
10. Her fraksiyonu temiz bir 12 mL ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4) ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    NOT: Numunelere eklenen PBS partikül içermemelidir, steril PBS'nin 0,22 μm'lik bir filtreden süzülmesi ve tuz çökelmesini önlemek için oda sıcaklığında saklanmasıyla sağlanmalıdır.
11. Üstüne 6 mL daha 1x PBS ekleyin ve tekrar dikkatlice karıştırın.
12. Küçük vezikülleri yeniden peletlemek için tüpleri 4 ° C'de 2 saat boyunca 100.000 x g'da ultrasantrifüj edin. Süpernatanı boşaltın ve protein analizi için veziküllerin parçalanmasından veya morfolojik analiz için EV'lerin yeniden süspansiyonundan önce tüpleri kurutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,45 μm filtre	VWR (VWR)	28145-505
12 mL ultrasantrifüj tüpleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	331372
5.5 mL ultrasantrifüj tüpleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	344057
FA-45-6-30 rotor	Eppendorf Belediyesi	5820715006
MLS-50 sallanan kova rotoru	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	367280
Optima MAX-XP Masaüstü Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	393315
Optima XE-100 ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	A94516
Optiprep (Optik Hazırlık	Sigma	D1556	Steril su çözeltisinde% 60 iyodiksanol
Refracto 30PX (refraktometre)	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 rotor	Eppendorf Belediyesi	5820759003
SW 41 Ti sallanan Kovalı Rotor	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	333790
Masaüstü 5804R santrifüj	Eppendorf Belediyesi	22623508