Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden (PBMNC'ler) İndüklenmiş Nöral Kök Hücrelerin (iNSC'ler) Üretilmesi: PBMNC'leri iNSC'lere Yeniden Programlamak için Sendai Virüsü Tabanlı Bir Prosedür

Özet

Kaynak: Zheng, W. et al. Transplantasyon Çalışmaları için Periferik Mononükleer Hücrelerden İndüklenmiş Nöral Kök Hücrelerin Üretilmesi ve Dopaminerjik Nöron Öncülerine Doğru Farklılaşma.J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMNC'ler) Sendai virüsü kullanılarak indüklenmiş nöral kök hücrelere (iNSC'ler) yeniden programlanmasını göstermektedir. Sendai virüsü, hücreleri yeniden programlamak için verimli ve güvenli bir araç sunan, entegre olmayan bir virüstür.

Protokol

>1. PBMNC'lerin SeV Enfeksiyonu ile iNSC'lere Yeniden Programlanması

1. Çözelti ve kültür ortamının hazırlanması
   1. 100 mg PDL'yi 100 mL_H2Oile 1 mg / mL'lik bir konsantrasyona çözerek bir poli-D-lizin (PDL) stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de 1 mL'lik alikotlarda saklayın.
   2. 100 mg insülini 20 mL 0.01 N HCl'de 5 mg / mL'lik bir konsantrasyona çözerek bir insülin stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de 1 mL'lik alikotlarda saklayın.
   3. 200 mL iNSC bazal ortamı hazırlamak için, 96 mL DMEM-F12 ve 96 mL bazik ortamı (Malzeme Tablosu) 2 mL 100x glutamin stok çözeltisi, 2 mL esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 2 mL N2 takviyesi ve 2 mL B27 takviyesi ile birleştirin. Kullanmadan önce 10 ng / mL rekombinant insan lösemi inhibitör faktörü, 3 μM CHIR99021 ve 2 μM SB431542 ekleyin. Ortamı filtreleyin ve 4 °C.
      'da saklayın not: Ortamı 2 hafta içinde kullanın. Kullanmadan hemen önce rekombinant insan lösemi inhibitör faktörü, CHIR99021 ve SB431542 ekleyin.
2. PBMNC'lerin SeV Enfeksiyonu ile iNSC'lere Yeniden Programlanması
   1. Kullanmadan önce temiz bir tezgahı ultraviyole ile sterilize edin. Tüm yüzeyleri ve ekipmanları %75 alkol ile sterilize edin. Bir otoklav kullanarak tüm uçları sterilize edin.
   2. 0. günde, hücreleri MNC ortamında toplayın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış MNC ortamı ile yeniden süspanse edin.
   3. Tripan mavisi ile canlı hücreleri sayın. Hücreleri önceden ısıtılmış (37 ° C) MNC ortamı ile 24 oyuklu plakalarda oyuk başına 2 x 10⁵ hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin.
   4. SeV tüplerini -80 °C'lik depodan çıkardıktan sonra, SeV içeren tüpleri 37 °C su banyosunda 5-10 saniye çözdürün ve ardından RT'de çözülmelerine izin verin. Çözüldükten sonra hemen buzun üzerine koyun.
   5. İnsan Klf4, Oct3/4, SOX2 ve c-MyC'yi kodlayan SeV'yi, 10'luk bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) kuyulara ekleyin. Hücrelerin bağlanmasını kolaylaştırmak için hücreleri 30 dakika boyunca 1.000 x g'da plakalarla santrifüjleyin. Hücreleri ve süpernatanı plakalarda bırakın. Plakaları 37 °C, %5 CO₂.
      sıcaklıkta inkübatöre yerleştirin DİKKAT: SeV ile ilgili tüm prosedürler bir güvenlik kabininde gerçekleştirilmeli ve tüm uçlar ve tüpler atılmadan önce etanol veya ağartıcı ile muamele edilmelidir.
   6. 1. günde, ortamı ve hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. İyiliği 1 mL MNC ortamı ile durulayın. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 24 oyuklu plakalarda 500 μL taze önceden ısıtılmış MNC ortamı ile yeniden süspanse edin.
      not: PDL / laminin üzerine kaplamadan önce herhangi bir hücrenin yapışmasını önlemek için düşük bağlantılı 24 oyuklu bir plaka kullanın.
   7. 2. günde, 1 mL 1 mg / mL PDL'yi 19 mL D-PBS ile 50 μg / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. 6 oyuklu plakaları RT'de en az 2 saat boyunca 50 μg / mL PDL ile kaplayın.
   8. 200 μL 0.5 mg / mL laminini 20 mL D-PBS ile 5 μg / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. PDL'yi 6 oyuklu plakalarda aspire edin ve dikey temiz tezgahta kurutun.
   9. 6 oyuklu plakaları 5 μg/mL laminin ile kaplayın ve 37 ° C'de 4-6 saat inkübe edin. Kullanmadan önce D-PBS ile yıkayınız.
   10. 3. günde, adım 1.2.6'da elde edilen transdüksiyon hücreleri, iNSC ortamında PDL / laminin kaplı 6 oyuklu plakalar üzerine plakalayın.
       not: Hücreler PDL/laminin kaplı plakalara yerleştirildikten sonra, hücrelerin yapışmasını bozmamaya çalışarak, gerekirse plakaları nazikçe hareket ettirin.
   11. 5. günde, 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) iNSC ortamını 6 oyuklu plakalara nazikçe ekleyin.
       not: Hücrelerin şiddetli bir ölüme uğraması beklenir (% >60).
   12. 7. günde, 6 oyuklu plakalarda her bir oyuğa 1 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) iNSC ortamı ekleyin.
   13. 9. günden 28. güne kadar, kullanılmış ortamı her gün önceden ısıtılmış (37 °C) iNSC ortamıyla değiştirin. iNSC kolonilerinin ortaya çıkışını izleyin. Yaklaşık 2-3 hafta içinde genişleme için iNSC klonlarını seçin ve aktarın. Muhtemelen kirletici hücreleri hariç tutarak, yanmış cam pipetler kullanarak uygun morfolojiye sahip kolonileri toplayın ve kolonileri 200 μL uçlarla aspire edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
B27 takviyesi	Canlandırıcı	17504044
CHIR99021	Gen Operasyonu	04-0004
DMEM-F12	Gibco (Gibco)	11330
DMEM-F12	Gibco (Gibco)	11320
Laminin	Roche	11243217001
N2 takviyesi	Canlandırıcı	17502048
NEAA (NEAA)	Canlandırıcı	11140050	Esansiyel olmayan amino asit
Nörobazal	Gibco (Gibco)	10888	Temel ortam
Pdl	Sigma-Aldrich	P7280 Serisi	Poli-D-lizin
SB431542	Gen Operasyonu	04-0010-10mg	-20'de ışıktan saklayın mı?
Sendai virüsü	Yaşam Teknolojileri	MAN0009378
Insülin	Roche	12585014
24 oyuklu plaka	Corning	3337
15 ml konik tüp	Corning	430052
6 oyuklu plaka	Corning	3516
EPO (Çevre Koruma Teşkilatı	Peprotech teknolojisi	100-64-50UG	İnsan Eritropoietin
İnsan lösemi inhibitör faktörü	Değirmen gözeneği	LIF1010
İnsan rekombinant SCF	Peprotech teknolojisi	300-07-100UG
IGF-1 (İngilizce	Peprotech teknolojisi	100-11-100UG	İnsan insülin benzeri büyüme faktörü
IL-3 (İngilizce	Peprotech teknolojisi	200-03-10UG	İnsan interlökin 3
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
IMDM	Gibco (Gibco)	215056-023	Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'su
Insülin	Roche	12585014
ITS-X	Canlandırıcı	51500-056	İnsülin-transferrin-selenyum-X takviyesi
GlutaMAX	Canlandırıcı	21051024	100 × Glutamin stok çözeltisi
Jambon-F12	Gibco (Gibco)	11765-054
1-Tiyogliserol	Sigma-Aldrich	M6145	Soluma ve cilt teması için toksiktir
Askorbik asit	Sigma-Aldrich	A92902	Cilt temasında toksiktir
Nakavt serum değişimi	Gibco (Gibco)	10828028	Serum içermeyen bazal ortam
Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi	Canlandırıcı	11905031
Transferrin	Ar-Ge Sistemleri	2914-HT-100G
Tripan mavisi	Gibco (Gibco)	T10282

Serisi Serisi Gazetesi ) ) Gazetesi Sertifikası Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi