Dolaşımdaki Hücresiz DNA'nın (cfDNA) İzolasyonu: Kanser Hastalarının Kan Plazmasından cfDNA'yı Çıkarmak için Silika Bazlı Bir Membran Prosedürü

Özet

Kaynak: Palande, V. et al. Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, insan plazma örneğinden dolaşımdaki hücresiz DNA veya cfDNA'yı izole etmek için silika bazlı bir membran prosedürü açıklanmaktadır. cfDNA, kanser teşhisi ve değerlendirmesi için umut verici bir biyobelirteçtir.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Dolaşımdaki cfDNA'nın 1 mL Plazmadan Saflaştırılması

NOT: Bu adım ticari bir kit ile gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Tüm tamponlar kit ile birlikte verilir.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
   Dikkat: Numune hazırlama atıklarına doğrudan asidik çözeltiler veya ağartıcı eklemeyin. Lizis tamponu, Bağlama tamponu ve Yıkama Tamponu-1'de bulunan guanidin tuzları, ağartıcı veya asitlerle birleştirildiğinde oldukça reaktif bileşikler üretebilir.
   1. Bağlama tamponu: 500 mL çalışma Bağlama tamponu yapmak için 300 mL Bağlayıcı tampon konsantresini 200 mL %100 izopropanol ile karıştırın. Oda sıcaklığında saklayın.
      not: Bağlayıcı tampon, dolaşımdaki nükleik asitlerin silika membrana optimum şekilde bağlanmasını sağlar. 500 mL bağlayıcı tampon, sırasıyla 1, 2, 3, 4 veya 5 mL plazmadan 276, 138, 92, 69 veya 55 numunenin işlenmesi için yeterlidir ve oda sıcaklığında 1 yıl boyunca stabildir.
   2. Yıkama Tamponu-1: 19 mL Yıkama Tamponu-1 konsantresini 25 mL %96-100 etanol ile karıştırarak 44 mL çalışan Yıkama Tamponu-1 elde edin. Oda sıcaklığında saklayın.
      not: Yıkama Tamponu-1, silika membrana bağlı kirleticileri ortadan kaldırır. 44 mL çalışan Yıkama Tamponu-1, 73 numunenin 1/2/3/4/5 mL plazmasını işlemek için yeterlidir ve oda sıcaklığında 1 yıl boyunca stabildir.
   3. Yıkama Tamponu-2: 13 mL Yıkama Tamponu-2 konsantresini 30 mL %96-100 etanol ile iyice karıştırarak 43 mL çalışan Yıkama Tamponu-2 elde edin. Oda sıcaklığında saklayın.
      not: Yıkama Tamponu-2, silika membrana bağlı kirleticileri ortadan kaldırır. 43 mL çalışan Yıkama Tamponu-2, ~56 1/2/3/4/5 mL plazma örneğini işlemek için yeterlidir ve oda sıcaklığında 1 yıl boyunca stabildir.
   4. 310 μg liyofilize taşıyıcı RNA içeren bir tüpe, 0.2 μg/μL'lik bir taşıyıcı RNA çözeltisi hazırlamak için 1.550 μL Elüsyon tamponu ekleyin. Taşıyıcı RNA'yı iyice çözdükten sonra, çözeltiyi uygun alikotlara bölün ve -30 °C ila -15 °C arasında saklayın. Bu alikotları 3 defadan fazla dondurmayın. Lizis tamponuna, Tablo 1'de gösterildiği gibi, Elüsyon tamponunda çözülmüş sulandırılmış taşıyıcı RNA'yı ekleyin.
      not: Taşıyıcı RNA doğrudan Lizis tamponunda çözünmediğinden, önce bir Elüsyon tamponunda ve daha sonra Lizis tamponunda çözülmesi gerekir. İlk olarak, silika membran-nükleik asitlerin bağlanması, numunede çok az hedef molekül bulunduğunda arttırılır. İkinci olarak, büyük miktarlarda taşıyıcı RNA'nın varlığı nedeniyle RNA bozunması riski azalır.
2. İzolasyona başlamadan önce, sütunları ve numuneleri oda sıcaklığına getirin ve gerekirse steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile numune hacimlerini 1 mL'ye ayarlayın. 50 mL santrifüj tüpleri ve 2 mL toplama tüpleri içeren 2 su banyosunu veya ısıtma bloğunu sırasıyla 60 °C ve 56 °C'ye önceden ısıtın.
3. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 100 μL Proteinaz K, 1 mL plazma ve 1.0 μg taşıyıcı RNA içeren 0.8 mL Lizis tamponu ekleyin (adım 1.1.4'te hazırlanmıştır). Santrifüj tüpünü bir kapakla kapatın ve tüpte görünür bir girdap sağlarken içeriği 30 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. Verimli lizis için içeriğin iyice karıştırılması önemlidir.
   not: Girdaplamadan hemen sonra, gecikmeden adım 1.4'e geçin.
4. Çözeltiyi 60 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
5. Kapağı çıkarın, tüpe 1.8 mL bağlayıcı tampon ekleyin ve kapağı yerleştirdikten sonra 15-30 saniye boyunca nabız girdabı ile iyice karıştırın.
6. Elde edilen karışımı buz üzerinde 5 dakika inkübe edin ve silika membran kolonunu vakum pompasına bağlı vakum aparatına yerleştirin. Ardından, numune sızıntısını önlemek için açık kolona 20 mL'lik bir tüp uzatıcı sıkıca yerleştirin.
7. İnkübe edilmiş karışımı dikkatlice kolonun tüp uzatıcısına dökün ve vakum pompasını açın. Tüm lizat karışımı kolonlardan tamamen geçtikten sonra, vakum pompasını kapatın, basıncı 0 mbar'a bırakın ve tüp genişleticiyi çıkarın ve atın.
   not: Çapraz kontaminasyondan kaçınarak, bitişik kolonlara yayılmasını önlemek için tüp genişletici dikkatli bir şekilde atılmalıdır.
8. Kolonu vakum aparatından çıkarın, toplama tüpüne yerleştirin ve kalan lizatı gidermek için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 11.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
9. Kolona 600 μL Yıkama Tamponu-1 ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleyin, akışı atın.
10. Kolona 750 μL Yıkama Tamponu-2 ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
11. Kolona 750 μL etanol (%96-100) ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
12. Kolonu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirerek 3 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.
13. Membran kolon tertibatını, kapağı açık olarak 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirerek ve 56 °C'de 10 dakika inkübe ederek tamamen kurutun.
14. Kolonu temiz bir 1,5 mL elüsyon tüpüne yerleştirin. Kolon zarının merkezine 20–150 μL Elüsyon tamponu uygulayın ve kapak kapalıyken oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
    not: Elüsyon tamponunun oda sıcaklığına dengelendiğinden emin olun. 50 μL'den daha düşük elüsyon tamponu kullanılması durumunda, zarın merkezine dikkatlice dağıtıldığından emin olun. Bu, bağlı DNA'nın tam elüsyonuna yardımcı olur. Bununla birlikte, elüsyon hacmi sabit değildir ve aşağı akış uygulamalarına göre değiştirilebilir. Geri kazanılan elüat, 5 μL'ye kadar olabilir ve kesinlikle kolona uygulanan elüsyon hacminden daha az olabilir.
15. Nükleik asitleri elüte etmek için geri kazanılan elüatı 20.000 x g'da bir mikrosantrifüjde 1 dakika santrifüjleyin ve -20 ° C'de saklayın.

Numune numarası	Lizis tamponu (mL)	Elüsyon tamponundaki taşıyıcı RNA (μL)
1	0,9	5,6
2	1.8	11.3
3	2.6	16,9
4	3.5	22,5
5	4.4	28,1
6	5.3	33,8
7	6.2	39,4
8	7	45
9	7,9	50,6
10	8,8	56,3
11	9,7	61,9
12	10,6	67,5
13	11,4	73,1
14	12,3	78,8
15	13.2	84,4
16	14.1	90
17	15	95,6
18	15,8	101,3
19	16,7	106,9
20	17,6	112,5
21	18,5	118,1
22	19,4	123,8
23	20.2	129,4
24	21,1	135

Tablo 1. 1 mL plazma numunelerinin işlenmesi için gerekli olan Lizis tamponu ve taşıyıcı RNA (Elüsyon tamponunda çözülmüş) hacimleri.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti	Agilent Teknolojileri A.Ş.	5067-4626	Yüksek Hassasiyetli DNA tahlilleri genellikle yeni nesil dizileme kütüphaneleri için numune kalite kontrolü için kullanılır.
cf-DNA/cf-RNA Koruyucu Tüpler	Norgen Biotek A.Ş.	63950	Norgen'in cf-DNA / cf-RNA Koruyucu Tüpleri, depolama ve nakliye sırasında insan tam kan örneklerinde cfDNA, dolaşımdaki tümör DNA'sı, cf-RNA ve dolaşan tümör hücrelerinin toplanması ve korunması için kapalı, boşaltılmış plastik tüplerdir
QIAamp dolaşımdaki nükleik asit kiti	Keçi	55114	QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asit Kiti, bu dolaşımdaki nükleik asitlerin insan plazmasından veya serumundan ve diğer hücresiz vücut sıvılarından verimli bir şekilde saflaştırılmasını sağlar.
QIAvac 24 Plus vakum manifoldu	Keçi	19413	QIAvac 24 Plus vakum manifoldu, QIAGEN kolonlarının paralel olarak vakumla işlenmesi için tasarlanmıştır.
QIAvac Bağlantı Sistemi	Keçi	19419	QIAvac Bağlantı Sistemi ile birlikte QIAvac 24 Plus vakum manifoldu, bir akış sistemi olarak kullanılabilir. Muhtemelen bulaşıcı materyal içeren numune akışı, ayrı bir atık şişesinde toplanır.
QIAvac Bağlantı Sistemi	Keçi	19419	QIAvac Bağlantı Sistemi ile birlikte QIAvac 24 Plus vakum manifoldu, bir akış sistemi olarak kullanılabilir. Muhtemelen bulaşıcı materyal içeren numune akışı, ayrı bir atık şişesinde toplanır.
çeşitli
50 mL santrifüj tüpleri
Kırılmış buz
Etanol (%96-100)
56 °C'de ısıtma bloğu veya benzeri (2 mL toplama tüpünü tutabilir)
İzopropanol (% 100)
Mikrosantrifüj
Fosfat tamponlu salin (PBS)
Pipetler (ayarlanabilir)
Steril pipet uçları (çapraz kontaminasyonu önlemeye yardımcı olmak için aerosol bariyerli pipet uçları önerilir)
60 °C'de 50 mL santrifüj tüplerini tutabilen su banyosu veya ısıtma bloğu