cfDNA'nın Otomatik Kapiler Elektroforez Tabanlı Parça Boyutu Dağılımı Analizi: Biyosıvılardan İzole Edilen DNA Parçalarının Boyut Dağılımını İncelemek İçin DNA Mikroçip Tabanlı Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Palande, V. et al. Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA'nın Tespiti. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, otomatik kılcal elektroforez kullanarak hücresiz DNA veya cfDNA fragmanlarının boyut dağılımını analiz ediyoruz. Bu teknik, apoptoz sırasında kanser hücreleri tarafından salınan DNA parçalarının profili hakkında bilgi edinmeye yardımcı olur.

Protokol

1. Fragment Analyzer ile cfDNA'nın DNA Fragman Boyutu Dağılımı

1. Prosedürü başlatmadan önceki adım: DNA boya konsantresini ve DNA jel matrisini 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengeleyin.
2. Jel-boya karışımının hazırlanması
   not: DMSO'nun organik moleküllerin dokulara girişini kolaylaştırdığı bilindiği için çözeltileri dikkatli kullanın.
   1. DNA boya konsantre şişesini 10 saniye boyunca vorteksleyerek DMSO'yu iyice çözün. Bu konsantrenin 15 μL'sini bir DNA jel matris şişesine pipetleyin ve karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
   2. Yine, jel ve boyanın karışımı görüntülenene kadar kapaklı şişeyi 10 saniye boyunca vorteksleyin.
   3. Karışımı bir döndürme filtresinde üst kaba dökün.
   4. Sıkma filtresini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.240 x g ± %20'de mikrosantrifüjleyin.
   5. Hazırlanan jel boyayı tüpte etiketleyin ve iyi laboratuvar uygulamalarına göre filtreyi atın. Tüpü etiketleyin ve hazırlama tarihini kaydedin.
      not: Filtratı iyi laboratuvar uygulamalarına göre atın. Jel-boya karışımı, 5 Yüksek Hassasiyetli (HS) DNA çipi için kullanılabilir. 1 saatten fazla kullanılmazsa 4 °C'de saklayın. Karanlıkta saklama 6 haftaya kadar mümkündür.
3. Jel-boya karışımını yüklemek için, talaş hazırlama istasyonunun taban plakasının konumunu sağlayın ve klipsi en düşük konuma ayarlayın.
   1. Işığa maruz kalmayı izlerken jel-boya karışımını 30 dakika oda sıcaklığına dengeleyin.
   2. Kapalı bir torbadan yeni bir HS DNA çipi alın ve çip hazırlama istasyonuna yerleştirin, ardından 9.0 μL jel-boya karışımını çıkarın ve 'G' olarak işaretlenmiş çip kuyusunun dibine dağıtın.
      not: Şişenin dibinde birikebilecek parçacıklardan kaçınarak jel-boya karışımını hazırlayın. Jel-boya karışımını HS DNA çipine iyice dağıtırken, büyük hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için pipetin ucunu tamamen yerleştirin. Ayrıca, pipete kuyu kenarlarına dokunmak kötü sonuçlar doğuracaktır.
   3. Pistonu 1 mL'ye yerleştirin ve talaş hazırlama istasyonunu kapatın. Mandalın kilidinin tıklandığından emin olun ve zamanlayıcıyı 60 s'ye ayarlayın, ardından pistonu klips tarafından tutulana kadar aşağı bastırın ve tam olarak 60 saniye sonra, klips serbest bırakma mekanizmasıyla pistonu serbest bırakın.
   4. Piston en az 0,3 mL işaretine geri çekildiğinde, 5 saniye bekleyin ve ardından yavaşça 1 mL konumuna geri çekin, ardından çip hazırlama istasyonunu açın ve tekrar 9,0 μL jel-boya karışımını çıkarın ve 'G' olarak işaretlenmiş HS DNA çipinin dibine dağıtın.
4. DNA işaretleyicisini yüklemek için, 5 μL DNA işaretleyicisini merdiven sembolü ile işaretlenmiş kuyuya dağıtın. 11 numune kuyusunun tümü için prosedürü tekrarlayın.
5. Merdiveni ve numuneleri yüklemek için, merdiven sembolü ile işaretlenmiş kuyucuğa 1 μL DNA merdiveni dağıtın ve ardından 11 numune kuyucuğunun tümüne 1 μL numune (kullanılmış kuyucuklar) veya 1 μL işaretleyici (kullanılmayan kuyucuklar) ekleyin.
6. Çipi adaptöre yatay olarak yerleştirerek HS DNA çipini 2.400 rpm'de 60 saniye boyunca vorteksleyin. HS DNA çipini sabitleyen çıkıntının girdap sırasında hasar görmediğinden emin olun.
7. HS DNA çipini parça analizörü cihazına yerleştirmek için kapağı açın ve elektrot kartuşunun düzgün şekilde yerleştirildiğinden ve çip seçicinin parça analizörü cihazında 'dsYüksek Hassasiyetli DNA' olarak konumlandırıldığından emin olun.
8. HS DNA çipini, yalnızca tek yöne uyan yuvaya dikkatlice monte edin, ardından elektrot kartuşunun HS DNA çipinin kuyularına tam olarak oturduğundan emin olarak kapağı kapatın.
9. Parça analizörü yazılım ekranındaki ekran, takılan HS DNA çipini ve ekranın sol üst köşesindeki çip simgesi aracılığıyla kapalı kapağı gösterir.
10. HS DNA çip çalışmasını başlatmak için, cihaz ekranındaki 'Tahlil' menüsünden dsDNA Yüksek Hassasiyetli Tahlil'i seçin, ardından numune adları ve yorumlar gibi bilgileri besleyerek numune adları tablosunu uygun şekilde doldurun ve ekranın sağ üst köşesindeki 'Başlat' düğmesine tıklayarak çip çalışmasını başlatın.
11. Bir HS DNA çipi çalışmasından sonra elektrot temizliği: Test tamamlanır tamamlanmaz kullanılmış HS DNA çipini hemen çıkarın ve iyi laboratuvar uygulamalarına göre atın. Elektrotların önceki testten kalan kalıntılar olmadan temiz olduğundan emin olmak için aşağıdaki prosedürü uygulayın.
    1. Elektrot temizleyici kuyularından birine 350 μL deiyonize analiz dereceli suyu yavaşça doldurun ve kapağı açarak elektrot temizleyiciyi parça analiz cihazına yerleştirin ve ardından kapağı kapatın ve yaklaşık 10 saniye bekleyin.
    2. Kapağı açarak elektrot temizleyiciyi çıkarın ve kapağı kapatmadan önce elektrotların üzerindeki suyun buharlaşması için 10 saniye daha bekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2100 Biyoanaliz Cihazı	Agilent Teknolojileri A.Ş.	G2939BA	2100 Biyoanalizör sistemi, biyomoleküllerin numune kalite kontrolü için kurulmuş bir otomatik elektroforez aracıdır.
Hazırlama istasyonu için ayarlanabilir klips	Agilent Teknolojileri A.Ş.	5042-1398	Talaş hazırlama için tanımlanmış basıncı uygulamak için şırınga ile birlikte kullanılır.
cf-DNA/cf-RNA Koruyucu Tüpler	Norgen Biotek A.Ş.	63950	Norgen'in cf-DNA/cf-RNA koruyucu tüpleri, depolama ve nakliye sırasında insan tam kan örneklerinde cf-DNA, dolaşımdaki tümör DNA'sı, cf-RNA ve dolaşan tümör hücrelerinin toplanması ve korunması için kapalı, boşaltılmış plastik tüplerdir
Talaş Hazırlama İstasyonu	Agilent Teknolojileri A.Ş.	5065-4401	RNA, DNA ve protein tahlilleri için kullanılan her bir tahlil kitiyle birlikte verilen bir şırınga ile jel matrisini bir çipe yüklemek için kullanılır. Doldurma istasyonu, kronometre ve 1 şırınga klipsi içerir
Elektrot Temizleyici Kiti	Agilent Teknolojileri A.Ş.	5065-9951	Çapraz kontaminasyonu önler. Elektrotlardan bakteri veya protein kirleticilerini giderir.
Jel Matris için Filtreler	Agilent Teknolojileri A.Ş.	185-5990	DNA boya konsantresi ve DNA jel matrisinin uygun şekilde karıştırılması için kullanılır
IKA Temel Çip Vorteks	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	DNA merdiveni ve DNA örneğinin Biyoanalizör tahlil çipleri üzerinde uygun şekilde karıştırılması için kullanılır
50 ml santrifüj tüpleri
Etanol (%96-100)
56 °C'de ısıtma bloğu veya benzeri (2 ml toplama tüplerini tutabilir)
Fosfat tamponlu salin (PBS)
Pipetler (ayarlanabilir)
Steril pipet uçları (çapraz kontaminasyonu önlemeye yardımcı olmak için aerosol bariyerli pipet uçları önerilir)
60 °C'de 50 mL santrifüj tüplerini tutabilen su banyosu veya ısıtma bloğu

Haber Bülteni numaralı telefondan ulaşabilirsiniz. Serisi