Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Bonner, E. R. et al. Hasta Biyosıvılarında Tümörle İlişkili Dolaşımdaki DNA'nın Tespiti ve İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR ile hedef nükleik asitleri tespit etmek için emülsifiye edilmiş nano damlacıklar oluşturmak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Protokol

1. dPCR Kullanarak Hedef DNA'nın Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

1. 220 μL genotipleme ana karışımı, 10 μM vahşi tip ve mutant probların her biri 8,8 μL, 10 μM ileri ve geri primerlerin her biri 39,6 μL ve 17,6 μL damlacık stabilize edici yağ ekleyerek PCR şerit tüpünün 8 oyuğu artı %10 ekstra için dPCR reaksiyon karışımını hazırlayın.
2. Tam hacmi 10-20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dPCR reaksiyon karışımını nazikçe karıştırın. Reaksiyon karışımına damlacık stabilize edici yağ eklendikten sonra girdap yapmayın veya santrifüj yapmayın.
3. Bir PCR 8 oyuklu şerit tüpü alın ve 38 μL dPCR reaksiyon karışımını doğrudan her bir oyuğun dibine dağıtın. Temiz bir pipet ucuyla baloncukları çıkarın.
   NOT: Birbirine kenetlenmiş veya sıkıca paketlenmiş PCR şerit tüpleri, statik elektrik yüklerine neden olarak dPCR verilerini analiz ederken birleşmeye ve gürültülü sinyale neden olabilir. Bunu önlemek için, tüpleri ayrı biyolojik tehlike torbalarına ayırın, torbaları aşırı paketlemekten kaçının ve tüplerin birbirine sürtünmesini önleyin.
4. PCR şerit tüpünün uygun kuyucuklarına 12 μL önceden amplifiye edilmiş DNA örneği ekleyin. Negatif kontrol için 12 μL MB H₂O.
   ekleyin NOT: CfDNA örneklerini replikat kuyucuklarında analiz edin. BOS için en az iki kopya halinde analiz edin ve plazma / serum için her bir örneği üç kopya halinde analiz edin.
5. Reaksiyon karışımını DNA örneği ile karıştırmak için tam hacmi 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
6. Yeni bir damlacık üreten cihaz çipi edinin ve PCR şerit tüpünün 1-8 numaralı kuyularından tam hacmi çipteki karşılık gelen A-H kanallarına pipetleyin. Kanalların alt kısımlarına pipet ucuyla dokunmaktan kaçının.
7. Yeni bir temiz PCR şerit tüpü edinin ve damlacık üreten cihaza yerleştirin. Damlacık oluşturan cihaz çipi kimliğini tarayın veya cihaz bilgisayarındaki yazılıma manuel olarak girin. 8 kanalın her biri için ad girin. Örnekleri damlatmaya başlamak için Çalıştırmayı başlat'a tıklayın.
8. Damlacık tamamlandığında, PCR şerit tüpünü çıkarın ve şerit tüp kapaklarını uygulayın.
9. Şerit tüpünü bir termal döngüleyiciye aktarın ve kuyucuk başına 80 μL su içeren başka bir şerit tüpü ile dengeleyin.
10. Termal döngü koşullarını şu şekilde programlayın: 10 dakika boyunca 95 ° C; İki sıcaklıkta 45 döngü: 30 saniye boyunca 95 ° C ve 2 dakika tavlama sıcaklığı; 10 dakika boyunca 98 ° C; ve 10 ° C'de tutun.
    1. Rampa hızını 0,5 °C/sn'ye ayarlayın ve numune hacmini 80 μL'ye ayarlayın.
11. Termal döngü tamamlandığında, şerit tüpünü çıkarın ve miktar tayin cihazına aktarın. PCR şerit kapaklarını çıkarın ve yüksek hızlı kapaklarla değiştirin.
12. Miktar tayin cihazını ve bağlı bilgisayarı cihaz yazılımı ile açın. Enstrüman yazılımını başlatın ve Configure a run (Bir çalıştırma ayarla) öğesine tıklayın.
13. Şerit tüpünü niceleme cihazına yerleştirin.
14. Yeni bir niceleme cihazı çipi edinin ve tarayın veya çip kimliğini cihaza manuel olarak girin. Çipi makineye yerleştirin.
15. Metal kalkanı çipin üzerine yerleştirin ve cihazın kapağını kapatın.
16. Bilgisayar yazılımında, dPCR çalıştırması ve 8 kanalın (AH) her biri için bir ad girin. Hızlı modu (yüksek hız sınırlarıyla kullanılmalıdır) seçin ve nicelemeyi başlatmak için Başlat'a tıklayın.
17. Miktar belirleme tamamlandığında, metal kalkanı (kaydedilecek ve yeniden kullanılmak üzere) çıkarın ve PCR şerit tüpünü ve çipi atın. Cihaz bilgisayarında, Çalıştırma Günlüğü her çalıştırma için sonuç dosyalarını içerecektir. Analist yazılımıyla analiz etmek için her örnek için .fcs dosyalarını kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Raindance Sarf Malzemesi Kiti	Biyo-Rad	20-04411	Damlacık üreten cihaz çipleri, miktar belirleme cihazı çipleri, yüksek hızlı kapaklar dahil PCR şerit kapakları ve damlacık stabilize edici yağ içerir
Raindance Sense Enstrümanı	Biyo-Rad		Niceleme aracı
Raindance Kaynak Enstrümanı	Biyo-Rad		Damlacık üreten cihaz
RainDrop Analist II Yazılımı	RainDance Teknolojileri		Veri Analizi için kullanılan analist yazılımı
Termo karıştırıcı C	Eppendorf Belediyesi	14 285 562ÖĞLEDEN SONRA
MiniAmp Termal Döngüleyici	Thermofisher Bilimsel	A37834
PCR 8 kuyulu şerit tüp kapakları	VWR (VWR)	10011-786
PCR 8 kuyulu şerit tüpleri	Aksiyen	PCR-0208-C
Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli 2x Master Mix	New England Biolabs Inc	M0494S Serisi