$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücre Kültürü ve İskele Hazırlama
NOT: Farelerde implantasyondan 48 saat önce iskeleler hazırlanmalıdır. Aşağıdaki ciltler iskele bazında verilmiştir. Ek iskeleler için miktarları gerektiği kadar çarpın.
- Poli (laktik asit) (PLA) iskeleleri rezeksiyon boşluğu boyutunda (yaklaşık 2 mm x 2 mm) parçalar halinde kesin. İskeleler, tekrarlanabilirlik için makas kullanılarak veya bir delgeç kullanılarak elle kesilebilir.
- 15 dakika boyunca %70 etanole batırarak sterilize edin ve ardından PBS'ye daldırın. Hücreleri tohumlama için hazırlarken Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin içeren modifiye edilmiş Eagle's besiyerine (DMEM) iskele yerleştirin.
- % 0.05 tripsin (bir T3 şişesi için 5-75 mL) kullanarak kültürlenmiş MSC'leri kaldırın. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Hücrelerin kalktığından emin olun, ardından tripsini etkisiz hale getirmek için şişeye 7-10 mL DMEM ekleyin.
- Şişe içeriğini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleme yoluyla her iskele için 5 x 105 MSC'yi saçmalayın.
- Süpernatanı aspire edin ve MSC'leri 5 x 105 hücre başına 5 μL DMEM'de yeniden süspanse edin.
- İskeleleri kurulayarak tohumlama için hazırlayın.
- Forseps ile DMEM daldırmadan bir iskeleyi çıkarın ve geçici olarak 6 oyuklu plakanın kapağına yerleştirin. İskeleyi kapaktan kaldırın ve geride bir damla fazla DMEM bırakın.
- İskeleyi yeni ve kuru bir yerde tekrar kapağın üzerine yerleştirin. 3-5 kez tekrarlayın, ardından kısmen kurutulmuş iskeleyi tohumlama için 6 oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin. Her iskele için tekrarlayın.
not: Kısmen kurutulmuş bir iskele, optimum hücre tohumlama sonuçları sağlar. İskele çok ıslaksa, hücreler iskeleden kayacak ve aşağıdaki kuyu plakasına yapışacaktır. İskele çok kuruysa, damlacık tüm iskeleye yayılmaz ve bu da zayıf ilk hücre dağılımına neden olur.
- Bir pipet kullanarak, bazı hücreler dibe çökmüş olabileceğinden, süspansiyonu homojenize etmek için kök hücre şişesini nazikçe karıştırın.
- 2,5 μL taze karıştırılmış MSC süspansiyonunu doğrudan iskelenin üzerine yavaşça pipetleyin ve iskelenin üst kısmında küçük bir damlacık oluşturun.
- Her kuyucuğun kenarlarına 300 μL DMEM ekleyin. Bu, hücre damlacığının hızlı buharlaşmasını önleyecektir. 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve hücrelerin iskeleye yapışmasına izin verin.
- Forseps ile iskeleleri kuyu plakasında yavaşça ters çevirin. Tohum: 2.5 μL taze karıştırılmış MSC süspansiyonu (bu, iskele başına ekilen toplam 5 x 105 hücre ile sonuçlanır). 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve hücrelerin iskeleye yapışmasına izin verin.
- 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 2 mL ekleyerek iskeleleri DMEM'de örtün. Ortamın altlarından akmasına izin vermek için iskeleleri yavaşça kaldırın. İmplantasyon ameliyatından önce bu durumda 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 24 saat sonra iskeleleri kontrol edin ve pH dengesizliği nedeniyle aşırı buharlaşma veya renk değişikliği gözlenirse ortam ekleyin/değiştirin.