Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Glioblastoma Hücrelerinin FP635 veya FP720 Yapısı ile Etiketlenmesi
- Lentivirüsü aşağıda açıklanan protokole göre üretin ve saflaştırın:
- 1. Günde ekilen yemekleri gözlemleyin. Hücreler %80-90 birleştiğinde transfeksiyona hazırdırlar.
NOT: Hücreler hala 1-2 hücre bölünmesine maruz kalacak alana sahip olmalıdır
- Dört plazmidi 50 mL'lik bir tüpe alikode ederek plazmit karışımını hazırlayın. 12 × 15 cm'lik bir tabak hazırlığı için 270 μg transfer vektörü, 176 μg pMDL (Gag/Pol), 95 μg pVSVG (veziküler stomatit virüsü glikoproteini) ve 68 μg pREV kullanın.
- 13.5 mL 0.25M CaCl2 hazırlayın (filtrelenmiş ddH2O ile seyreltin) ve plazmit karışımına ekleyin. 13.5 mL 2× BBS çözeltisi ekleyin. Birkaç kez ters çevirerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında (22–26°) 15 dakika inkübe edin.
- Transfeksiyon karışımını (damlalar halinde yayılmış) her bir plakaya ekleyin (plaka başına 2.25 mL). Plakaları nazikçe döndürün ve gece boyunca (16-20 saat)% 3 CO2, 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri gözlemleyin. Birleşmeye ulaşıyor olmalılar. Lentivektör plazmidinde görünür bir belirteç (GFP gibi) varsa, transfeksiyon verimliliği görsel olarak değerlendirilebilir. İdeal olarak, transfeksiyon verimliliği %>90 olmalıdır.
- Ortamı çıkarın, her yemeğe 15 mL taze DMEM +% 2 FBS ekleyin ve% 10 CO2, 37 ° C'ye aktarın. Gece boyunca inkübe edin.
- Süpernatantın ilk hasadını toplayın: Bulaşıklardan süpernatanı (12 tabak × 15 ml/tabak = 180 mL) toplayın ve havuzlayın.
- Her yemeğe 15 mL taze DMEM +% 2 FBS ekleyin. Bulaşıkları gece boyunca %10 CO2, 37 °C'de inkübe edin. Lentiviral süpernatan içeren kap ikincil bir muhafazaya konulmalı (kapalı bir plastik torba yeterli olacaktır) ve 4 ° C'de saklanmalıdır.
- Viral preparasyonu konsantre edin: Viral partikülleri ultrasantrifüjleme ile konsantre edin. Süpernatanı 20 ° C'de 2 saat boyunca 70.000 x g'da santrifüjleyin. Konik borular (yuvarlak tabanlı boruların aksine) ve sallanan kova rotorları (sabit açılı rotorların aksine) önerilir (çünkü bu kombinasyon neredeyse görünmez peletin bulunmasını kolaylaştırır). 20 ° C'de 2 saat boyunca 19.400 rpm'de Beckman SW28 rotorlu (altı tüp kapasiteli) konik borular kullanıyoruz. Tüpleri 30 mL süpernatan ile doldurun. 12 × 15 cm'lik bir tabak hazırlığından elde edilen toplam süpernatan hacmi 360 mL'dir; Bu nedenle, tam hacmin işlenmesi iki ardışık dönüş gerektirecektir. Tüpleri yükleyin, ilk dönüşü yapın, peleti bozmadan süpernatanı boşaltın, taze viral süpernatan ile yeniden doldurun ve ikinci dönüşü gerçekleştirin.
- Süpernatanı dökün ve ters çevrilmiş tüpleri kağıt havluların üzerine koyarak kalan sıvının boşalmasına izin verin. Peletteki tüm sıvıyı çıkarmak için kalan damlacıkları bir aspiratör kullanarak sifonlayın. Pelet, küçük yarı saydam bir nokta olarak zar zor görünmelidir.
- Viral peletleri 100 μL 1× HBSS'de yeniden süspanse edin. Köpürtmekten kaçının. Tüpleri 100 μL 1× HBSS ile durulayın. 200 μL nihai hacim elde etmek için her iki hacmi de birleştirin.
- Vidalı kapaklı bir mikrofüj tüpüne aktarın, parafilm içine sarın ve 15-30 dakika boyunca düşük hızda girdap yapın. Yeniden askıya alınan viral preparat, berrak ila hafif sütlü arasında herhangi bir yerde görünecektir.
- Masa üstü bir mikrosantrifüj üzerinde 10 saniye döndürerek süspansiyonu temizleyin. Süpernatanı yeni bir vidalı kapaklı mikrofüj tüpüne aktarın. Süpernatantın 20 μL'lik alikotlarını yapın. Bu viral süpernatant, in vitro derece kalitededir.
- DMEM ile bir insan glioma hücre hattından yaklaşık 2.0 x 106 hücre ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) 15 cm'lik bir tabakta kültür; veya kültür 2.0 x 106 insan glioblastoma hastadan türetilmiş (GBM-PDX) küreler DMEM / F12 1: 1 orta B27 takviyesi artı insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (EGF; 20 ng / mL) ve FGF (10 ng / mL) bir T75 şişesinde.
- Tüm hücreleri 37 °C, %5CO2 ve %100 bağıl nemde tutun.
- Hücreleri ayırın.
- Glioma hücreleri için: süpernatanı plakalardan çıkarın ve glioma hücrelerine 3-5 mL tripsin 1X ekleyin.
- GBM küreleri için: hücreleri 15 mL'lik bir tüpe pipetleyerek hücreleri toplayın.
- Oda sıcaklığında bir masa üstü santrifüj kullanarak GBM kürelerini 200 x g'da 5 dakika boyunca döndürün.
- Süpernatanı çıkarın ve 3-5 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin.
- Tüm hücreleri 37 ° C'de 10-15 dakika inkübe edin.
- Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri dikkatlice ayırın (kürelerin ve glioma hücrelerinin ayrışmasının tamamlandığından emin olun) ve 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
- Süpernatanı çıkarın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri 5 mL ortamla yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlaması ile hücre canlılığını belirleyin.
- 10 cm'lik bir tabakta 1.0 x10 6 hedef hücreyi pipetleme ile 5 mL orta ile yerleştirin.
- Enfeksiyon çokluğu (MOI) 5'te floresan proteinleri eksprese eden lentivirüslü hücreleri aktarın ve 37 ° C'de inkübe edin.
- 24 saat sonra, ortamı transdüksiyonlu hücrelerden çıkarın, 5 mL taze ortam ekleyin ve 37 ° C'de 48 saat daha inkübe edin.
- Enfekte olmuş hücreleri, yukarıda tarif edildiği gibi tripsin kullanarak tek hücreli bir süspansiyona ayırın. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün ve 500 μL ayırma çözeltisinde (% 1 FBS ile fosfat tamponlu salin (PBS)) yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu FACS tüplerine pipetleyin. Ölü hücreleri dışlamak için hücreleri 1 μL / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) dihidroklorür ile birlikte boyayın. Akış sitometresi kapılarını ayarlamak için negatif kontroller gereklidir (transdüksiyonsuz hücreler ve transdüksiyonsuz hücreler / DAPI lekeli).
- Floresan pozitif / DAPI negatif hücreleri sıralama çözeltisine sıralayın ve sıralanan hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
- Sıralanan hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün, süpernatanı çıkarın ve 5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. Ayıklanan hücreleri 10 cm'lik bir tabağa pipetleme ile tohumlayın. 37 °C'de en az 48-72 saat inkübe edin.
- Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi ayırarak ve in vivo deneyler için birden fazla tabağa kaplayarak sıralanan hücreleri genişletin.
