İlaç Tedavisi Çalışmaları için Beyin Tümörü Kök Hücre (BTSC) Migrasyon Testi: İlaç Tedavisinin BTSC'lerin Migrasyonu Üzerindeki Etkisini Analiz Etmek İçin İn Vitro Canlı Hücre Görüntüleme Tekniği

Özet

Kaynak: Restall, I. et al. Glioblastoma Beyin Tümörü Kök Hücre Göçü ve İstilasını İncelemek için Canlı Hücre Görüntüleme Testleri. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, ilgilenilen ilacın kemotaksis migrasyon plakası kullanarak canlı beyin tümörü kök hücrelerinin migrasyonu üzerindeki etkisini analiz etmek için beyin tümörü kök hücre migrasyon testi yapıyoruz. Canlı hücre görüntüleme, tahlil sırasında hücre göçünün görselleştirilmesini ve ölçülmesini kolaylaştırır.

Protokol

1. Beyin Tümörü Kök Hücre Migrasyon Testi

1. Bir T25 şişesindeki 200.000 hücreyi, bir migrasyon testi gerçekleştirmeyi planlamadan 1-2 hafta önce 8 mL tam ortamda tohumlayın.
   not: Kaplama ile testin gerçekleştirilmesi arasındaki süre, kullanılan BTSC kültürünün büyüme hızına bağlı olarak değişecektir.
   1. Bir ilaç tedavisinin göç üzerindeki etkisini test etmek için, hücreleri, DMSO gibi uygun bir araçla ve ilgili ilaçla, uygun hacimlerde araç veya ilaç stokunu doğrudan hücreleri içeren ayrı ortam kuyularına ekleyerek ön işleme tabi tutun.
2. Kemotaksis migrasyon plakasını (Şekil 1A) ince bir kollajen tabakası ile kaplayarak hazırlayın.
   1. Kollajen ile kaplanması gereken 96 oyuklu bir kemotaksis plakasının kuyu sayısını hesaplayın. Her koşul için en az üç çoğaltma kuyusu ekleyin.
   2. 5 mg / mL tip I kollajen stoğunu, kültür dereceli suda% 0.14'e seyreltilmiş saf asetik asit içinde 0.2 mg / mL'ye seyreltin.
   3. 0.2 mg / mL kollajeni hem membran yerleştirme kuyucuklarına hem de kullanılmakta olan alt rezervuar kuyularına pipetleyin.
      not: Plakanın alt rezervuarları 225 μL gerektirir ve membran yerleştirme kuyuları uygun bir kaplama için 75 μL kollajen gerektirir.
   4. Migrasyon plakasını 1 saat boyunca 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin. Kollajen kaplamasını çizmeden kollajen solüsyonunu kuyulardan aspire edin.
   5. Kuyuları 2x steril 1x PBS ile yıkayın. Plaka hemen kullanılmayacaksa, PBS'yi aspire edin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce kemotaksis migrasyon plakasını oda sıcaklığına ısıtın.
3. Kemotaksis migrasyon plakasının alt haznesini hazırlayın.
   1. Kemoatraksit migrasyon plakasının alt rezervuar kuyucuklarına kemoatraksan olarak %10 FBS ile takviye edilmiş 225 μL ortamı (büyüme faktörleri olmadan) pipetleyin.
   2. Kabarcık oluşmasını önlemek için membran ekini alt hazneye belirli bir açıyla yavaşça yerleştirin.
4. Hücreleri, kemotaksis migrasyon plakasının membran ekine yerleştirin.
   1. Ayrışmış BTSC'leri 50.000 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğunda ortamda (büyüme faktörleri olmadan) yeniden askıya alın. Farklı ilaç tedavileri sırasında migrasyonu değerlendiriyorsanız medyaya ilaç ekleyin. Alternatif olarak, kaplama sırasında nihai ilaç konsantrasyonunu korurken, eşit sayıda ön işleme tabi tutulmuş hücre ve kontrol hücresi tohumlayın.
   2. Adım 1.4.1'den itibaren BTSC'lerin 50 μL'lik plakası, istenen arıtma koşulları altında migrasyon plakasının her bir kuyucuğuna yerleştirilir.
5. Kemotaksis göçünü görüntüleyin.
   1. Kemotaksis migrasyon plakasını canlı hücre görüntüleme sistemine yerleştirin ve otomatik görüntüleme yazılımını, 72 saate kadar her 1-2 saatte bir plakanın mikroskobik görüntülerini alacak şekilde ayarlayın. Ticari yazılımı kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), zaman çizelgesine sağ tıklayın ve tarama aralığını 24 saat boyunca her 2 saatte bir olarak ayarlayın
      not: Zaman aralığı ve toplam geçen süre, kullanılan BTSC kültürleri arasında değişecektir; Bireysel BTSC kültürleri ile deneyim kazanılana kadar 72 saat boyunca 2 saatlik aralıklarla başlayın. Otomatik bir görüntüleme sistemi mevcut değilse, aynı görüş alanının görüntüleri bir mikroskop ve görüntüleme yazılımına bağlı bir kamera ile manuel olarak elde edilebilir.
   2. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, tüm deney için görüntüleri elde edin ve hücreleri zarın arka planından ve göç gözeneklerinden ayıran analiz yazılımını kullanarak bir işleme tanımı oluşturun (Şekil 1B, kırmızı maske). Ticari yazılım kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), Yeni bir İşleme Tanımı seçin ve BTSC'ler için işleme tanımı ayarlarını 52 tohum eşiğine, 85 büyüme eşiğine, boyut (piksel) ayarlamalarına -1 ve minimum 200^μm2 alanına ayarlayın. Bu işleme tanımını zarın alt tarafına uygulayın. Hücreleri arka plan zarından doğru bir şekilde ayırt etmiyorsa bu analizi değiştirin.
   3. Üç kopya kuyucuğunun her biri için zarın alt tarafındaki hücre yüzey alanı olarak veri toplayın, bu da yalnızca gözeneklerden göç eden hücreleri sayar. Hücrelerin zaman içinde μm^2'deki (göç eden hücrelerin alanı) göçünün grafiğini çizin (Şekil 1C).
      not: Düzensiz kaplamanın herhangi bir etkisini önlemek için, ilk zaman noktasında zarın üst yüzeyinde kaplanan ve sayılan nispi hücre sayısının tüm tedavi koşulları arasında benzer olduğundan (tüm kuyucuklarda %20'den az varyasyon) emin olun. Ticari yazılım kullanılarak veri toplama (bkz. Malzeme Tablosu), adım 1.5.2'de oluşturulan işleme tanımı başlatılarak, Metrikler'e, ardından Grafik/dışa aktarma'ya ve ardından Veri dışa aktarma'ya tıklanarak gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: BTSC göçünün canlı hücre görüntülemesi. (A) Bu, BTSC'lerle migrasyon testini gerçekleştirmeden önce ince bir tip I kollajen tabakası ile kaplanmış 96 oyuklu bir kemotaksis migrasyon plakasının bir örneğidir. Görüntüler, i) üç parçanın tümünün (kapak, membran eki ve rezervuar) birlikte yerleştirildiği bir plakayı, ii) üç parçanın da ayrıldığını, iii) membran e...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Matrigel matrisi	Corning	356230
96 oyuklu plakalar	Eppendorf Belediyesi	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	156367
Falcon 15 mL konik boru	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	352096
Incucyte ClearView 96 Kuyulu Kemotaksis plakası	Essen Biyobilim	4582
IncuCyte Zoom Canlı Hücre Analiz Sistemi	Essen Biyobilim	4545
IncuCyte Zoom Canlı Hücre Analiz Yazılımı	Essen Biyobilim	2016A Rev1
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Sigma	D8537
Kültür sınıfı su	Lonza BioWhittaker	17-724Ç
Fetal sığır serumu (FBS)	Canlandırıcı	12483-020
Sıçan Kollajeni I	Trevigen Belediyesi	3440-100-01
Accumax hücre ayırma çözümü	Yenilikçi Hücre Teknolojileri	AM105

adet Serisi · Serisi