1. Beyin Tümörü Kök Hücre Nörosfer İnvazyon Testi
- Bir istila testi gerçekleştirmeyi planlamadan 1-2 hafta önce bir T25 şişesinde 8 mL tam ortamda 200.000 hücre tohumlayın.
not: Kaplamadan testin gerçekleştirilmesine kadar olan zamanlama, kullanılan BTSC kültürünün çoğalma hızına bağlı olacaktır.
- Ön işleme tabi tutulmuş hücreler için, nörosferler istila için kaplanmaya hazır olmadan önce önceden belirlenmiş zaman seyri için istenen konsantrasyonda ilgilenilen bileşiği şişeye ekleyin.
- Ortalama nörosfer boyutu yaklaşık 150-200 μm olana kadar bekleyin; tipik olarak, bu, kullanılan BTSC kültürüne bağlı olarak 7-14 gün sürer.
not: Şişede küre boyutlarının bir dağılımını gözlemlemek tipiktir.
- Şişeyi bir pipetle hafifçe karıştırın ve her tedavi koşulu için 500 μL BTSC nörokürelerini 1.5 mL'lik konik bir tüpe taşıyın; bu, üç çoğaltma kuyusunu plakalamak için kullanılacaktır.
NOT: Adım 1.3.1–1.3.2 isteğe bağlıdır ancak yeni bir BTSC kültüründeki ilk istila deneyi için önerilir.
- Kuyuya girecek nörokürelerin yoğunluğunu belirlemek için, adım 1.3'teki gibi 1.5 mL'lik bir tüp hazırlayın. Nörosferleri nazikçe karıştırın ve 100 μL'yi 96 oyuklu ayrı bir plakaya hareket ettirin ve nörosferlerin 5 dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
- Kuyunun aşırı kalabalık olmadan görüntülenecek bölgesinde birden fazla nöroküre olduğundan emin olmak için mikroskop altındaki nörokürelerin sayısını kontrol edin.
not: İstilacı nörosferler, komşu nörosferlerle etkileşime girmeden çapı üç katına çıkarmak için yeterli alana ihtiyaç duyar. Kuyucuk başına nörosfer sayısı, oyuk başına nörosfer sayısı sayılarak ve adım 1.3'te T25 şişesinden 1.5 mL konik tüpe daha fazla veya daha az nöroküre eklenerek ayarlanabilir.
- 1.5 mL'lik konik tüpü 1.3. adımdaki hücrelerle birlikte buz üzerine yerleştirin ve 1.5-1.7 adımlarını buz üzerinde gerçekleştirin.
- Nörosferlerin yerçekimi ile 1.5 mL konik tüpün dibine 5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve etiketli 96 oyuklu bir plakayı buz üzerinde önceden soğutun.
- Hücre dışı matriks proteinindeki nöroküreleri yeniden süspanse edin.
- Her tedavi koşulu için buz üzerinde 500 μL 0.4 mg / mL tip I kollajen çözeltisi hazırlayın: 459 μL ortam (büyüme faktörleri olmadan), 40 μL 5 mg / mL kollajen stok çözeltisi ve 0.92 μL steril ekleyin 1N NaOH (Tablo 1).
NOT: Tedavi koşulu başına 500 μL kollajen çözeltisi gereklidir: üç replike kuyucuğun her biri için 100 μL ve 200 μL fazlalık. İlaç tedavilerinin buraya, çözeltinin ortam bileşeninden çıkarılarak istenen nihai konsantrasyonda eklenmesi gerekir. Bu protokol, hücre dışı matriks proteini olarak tip I kollajenin kullanımını tanımlar; Bununla birlikte, herhangi bir hücre dışı matris proteini test edilebilir. Ek olarak, daha yavaş istila oranlarına sahip BTSC kültürleri için, istila oranını artırmak için medyada büyüme faktörleri veya FBS desteklenebilir.
- Adım 1.5'teki nöroküreler yerleştikten sonra, dibe çöken nörosfer peletini kaybetmeden mümkün olduğunca çok ortamı aspire edin. Adım 1.6.1'de hazırlanan kollajen çözeltisinin 500 μL'sinde nöroküreleri nazikçe yeniden süspanse edin.
- 100 μL kollajen ve nörosfer karışımını, buz üzerindeki 96 oyuklu plakanın üç kopya kuyusuna ekleyin. Nörokürelerin 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleşmesine izin verin.
- Kollajen polimerizasyonuna izin vermek için 96 oyuklu plakayı 5 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre aktarın.
- Hemen 96 oyuklu plakayı görüntülemeye hazırlanın.
- İstila başlamadan önce, kaplama sırasındaki nörosfer boyutu için referans olarak bir görüntü elde etmek için 96 oyuklu plakayı bir canlı hücre görüntüleme sisteminin tepsisine veya bir mikroskop sahnesine yerleştirin.
- İstila oranı düzleşene kadar her saat başı görüntü alın; tipik olarak, bu 24 saat içinde gerçekleşir
not: Görüntüleme aralığı, kullanılan ekipmana bağlı olarak değiştirilebilir. Görüntüleme aralığı ve toplam geçen süre, farklı invazyon oranlarına sahip BTSC kültürleri için de değiştirilebilir.
- BTSC'lerin zaman içinde matrisi istila ettikçe artan yüzey alanını belirleyin.
not: BTSC invazyonundaki farklılıkların kaplanan nörosferlerin sayısından veya boyutundan güçlü bir şekilde etkilenmemesini sağlamak için kaplama sırasında hücrelerin yüzey alanının, üç kopya kuyucuğun ortalaması olarak hesaplanan, farklı tedavi koşulları arasında benzer (tüm kuyucuklarda %20'den az varyasyon) olması gerekir.
- Canlı hücre analiz sistemi için, görüntü elde etmek için 10X'lik bir hedef kullanın ve üç çoğaltma kuyusu için kuyu başına dört görüntü elde edin. Kuyunun birleşme yüzdesi olarak temsil edilen göreli hücre yüzey alanını belirlemek için, kuyunun arka planı üzerindeki hücreleri özellikle vurgulayan bir işleme tanımı ayarlayın. Ticari yazılım kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), bir Yeni İşleme Tanımı seçin ve segmentasyon ayarını 0,8'e, minimum alanı 300μm2'ye ve eksantrikliği maksimum 0,99'a ayarlayın. Hücreleri arka plandan doğru bir şekilde ayırt etmiyorsa bu analizi değiştirin.
not: Zaman içinde nörosfer istilasını görüntülemek için başka yöntemler kullanılıyorsa, zaman içinde üç kopya kuyusu için birden fazla görüş alanı elde edilmesi önerilir. Ancak, her aralıkta tam olarak aynı görüş alanını görüntülememek, toplanan verilerin standart hatasını artıracaktır. Bilgisayar yazılımı, her görüntüdeki istilacı hücrelerin yüzey alanını ölçmeye yardımcı olmak için kullanılabilir.
- Her zaman noktasında her kuyucuk için toplam hücre yüzey alanı (göreceli veya mutlak) olarak veri toplayın ve üç çoğaltılan kuyunun ortalamasını belirleyin. Zaman içinde artan hücre alanını çizerek BTSC'lerin istilasının grafiğini çizin.
| Kollajen solüsyonu hazırlama |
| Stok [Kollajen] (mg/mL) | 5 |
| Son [Kollajen] (mg / mL) | 0,4 |
| İhtiyaç duyulan kuyu sayısı: | 5 |
| Toplam hacim (μL) | 500 |
| Stok kollajen hacmi (μL) | 40 |
| 1N NaOH hacmi (μL) | 0,92 |
| Ortam hacmi (μL) | 459 |
Tablo 1: 0.4 mg / mL tip I kollajen çözeltisinin hazırlanması. Listelenenler, tip I kollajen çözeltisinin bilinen başlangıç ve istenen son konsantrasyonlarıdır. Listelenen hacimler, nörosferleri üç replike kuyucuğuna, artı iki fazlalık için plakalamak için yeterlidir ve protokol adımı 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi tek bir tedavi koşulunu içerebilir.
