Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Desenli Slaytların Hazırlanması
- Mikro modelleme için Yüzey Hazırlığı
- 18 mm dairesel cam lamelleri 5 dakika boyunca hava / plazma aktivasyonu ile tedavi edin. Lamelleri 1 saat boyunca bir kurutucuda 100 μL (3-aminopropil) trietoksisilan içeren kapalı bir odaya yerleştirin.
- 100 mg / mL poli (etilen glikol)-süksinimidil valerat (moleküler ağırlık 5.000 (Peg-SVA)) ile 10 mM karbonat tamponunda, pH > 8 ile 1 saat inkübe edin. Ultra saf su ile iyice durulayın ve kimyasal bir başlık altında kurutun.
not: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4°C'de saklanabilir.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 14.7 mg / mL'de foto başlatıcı, 4-benzoil benzoil trimetilamonyum klorür (PLPP) ekleyin.
not: Bir PLPP jeli olan konsantre bir PLPP formu da kullanılabilir. PEG fırçasını bozmak için gereken daha kısa bir ultraviyole (UV) aydınlatma süresi ile sonuçlanır (100 mJ/mm2).
- Foto Başlatıcı Jel Biriktirme
- Slaytın ortasında birikmesi için 3 μL PLPP jel ve 50 μL mutlak etanol karışımı hazırlayın. Mutlak etanolün tamamen buharlaşmasına kadar numuneyi kimyasal bir başlık altına yerleştirin.
not: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4°C'de saklanabilir.
- Cam Slayt Mikro Modelleme
- Lameli bir Ludin haznesine monte edin ve otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin.
- Öngörülen mikro desenlere karşılık gelen görüntüleri yazılıma yükleyin. Bu parametreleri uygulayın: 4 x 4 kez replikasyon, 200μm aralık, 1.000 mJ / mm2 UV dozu. Otomatik UV aydınlatma işleminden sonra, PLPP'yi birden fazla PBS yıkama ile durulayın.
not: PLPP jel kullanılmışsa, deiyonize su ile kapsamlı yıkamalarla çıkarın,N2'lik bir akışta kurutun ve 4 °C'de saklayın.
- 30 dakika boyunca laminin (PBS'de 50 μg / mL) ile inkübe edin. PBS.
ile yoğun bir şekilde yıkayın
NOT: Saflaştırılmış yeşil floresan proteininin (GFP, PBS'de 10 μg/mL) floresan çözeltisi, floresan mikroskobu ile mikro desenleri görselleştirmek için laminin ile karıştırılabilir.
2. Ko-kültür için Nöronların ve GBM Hücrelerinin Hazırlanması
- Embriyonik Sıçan Hipokampal Nöronlarının Kültürü
- Embriyonik (E18) sıçanların hipokampusunu inceleyin ve dokuyu 15 mL'lik bir tüpte Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) / 1 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) / penisilin-streptomisin çözeltisine aktarın. Hipokampusu kurutmadan fazla çözeltiyi çıkarın.
- Penisilin (10.000 birim / mL) / streptomisin (10.000 μg / mL) ve 1 mM HEPES ile desteklenmiş 5 mL tripsin-etilendiamin tetra asetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. 2 adet HBSS / HEPES / penisilin-streptomisin solüsyonu ile yıkayın ve dokunun bu solüsyonda 2-3 dakika kalmasına izin verin.
- Köpürmeyi en aza indirmeye özen göstererek, her bir mendille 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek iki alevle parlatılmış Pasteur pipeti kullanarak dokuyu ayırın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun canlılığını değerlendirin. Nöronları aşağıda belirtildiği gibi mikro desenli lameller üzerine yerleştirin.
not: Ekstraksiyondan sonra hücre canlılık oranı %85-90'dır.
- Mikro Desenli Lameller Üzerindeki Nöronlar için Hücre Kültürü
- Mikro desenli cam slaytları PBS ile rehidre edin ve tam nöronal hücre kültürü ortamını inkübe edin.
- E18 Sprague-Dawley sıçanlarından elde edilen hipokampal nöronları, %3 at serumu ile zenginleştirilmiş nörobazal ortamda (NBM)cm2'de 50.000 hücre yoğunluğunda doğrudan mikro desenli cam lamel üzerine tohumlayın. Mikro desenli nöronları 48 saat boyunca inkübatöre (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirin < br />
not: ~ 6 saat sonra, primer hipokampal nöronların laminin mikro modellerine yapıştığı görülebilir.
- İnsan GBM Kök Benzeri Hücrelerin Nöronlar Üzerindeki Ko-kültürü
- Küre şeklindeki hücreler süspansiyon halinde büyüdükçe, süspansiyonu 200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Sferoidleri 5 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri 0.5 mL hücre ayrışma reaktifi ile inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de 5 dakika boyunca.
- 4.5 mL tam NBM ekleyin (daha önce tarif edildiği gibi B27 takviyesi, heparin, fibroblast büyüme faktörü 2, penisilin ve streptomisin ile tamamlanır) ve otomatik bir sayma tekniği kullanarak hücreleri sayın.
- %3 at serumu ile zenginleştirilmiş NBM'deki mikro desenli nöronal kültür üzerine 1.000 GBM hücre tohumlayın. Plakayı 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde inkübe edin.
