Primer Beyin Perisitlerinin İzolasyonu ve Kültürü: Endotel Hücre Kontaminasyonu Olmadan Sığır Beyin Kılcal Damarlarından Perisitleri İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Özet

Kaynak: Hørlyck, S. et al. Sitozolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisitlerinin Kültürü.J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, endotel hücre kontaminasyonu olmadan sığır beyin kılcal damarlarından perisitleri izole etme ve kültürleme prosedürünü gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Sığır Kılcal Damarlarının Tohumlanması ve Kültürlenmesi

1. 0. Gün: 0,7 mL kollajen IV stoğunu 6,3 mL PBS ile karıştırın. Solüsyonu bir T75 şişesine ekleyin ve şişeyi oda sıcaklığında (RT) 2 saat bekletin veya gece boyunca 4 °C'de bırakın.
2. Kollajen solüsyonunu şişeden çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın.
3. 7 mL fibronektin iş solüsyonu ekleyin ve şişeyi RT'de 30 dakika bekletin. Ardından, fibronektin çözeltisini çıkarın ve hemen ardından kılcal damarları tohumlayın.
4. 30 dakikalık bekleme süresi boyunca, bir şişe kılcal damarı 37 ° C'lik bir su banyosunda çözdürün.
5. Kılcal damarlar çözüldüğünde, hemen 30 mL DMEM-comp içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve 500 x g ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin. DMEM-comp'u tüpten çıkarın ve kılcal peleti 10 mL taze DMEM-comp içinde yeniden süspanse edin.
6. 10 mL süspansiyonu kaplanmış T75 şişeye aktarın ve kılcal damarları% 10 CO₂.
   'de 37 ° C'lik bir inkübatörde 4-6 saat boyunca şişenin dibine yapışmaya bırakın not: Hücre büyüme hızı, geleneksel %5 CO₂ yerine %10 CO_2'de daha yüksektir.
7. 4-6 saatlik inkübasyondan sonra, şişeyi ışık mikroskobu altında inceleyin. Kılcal damarların fraksiyonları şimdi şişenin dibine takılmalıdır (Şekil 1, gün 0).
8. GM'yi hazırlayın ve DMEN-comp ortamını kılcal damarlardan çok dikkatli bir şekilde aspire edin ve 10 mL taze yapılmış GM ile değiştirin.
9. 2. Gün: GM'yi kılcal damarlardan çıkarın ve 10 mL taze yapılmış GM ile değiştirin. Bu noktada kılcal damarlardan hücresel büyüme ışık mikroskobu altında görülebilmelidir (Şekil 1, gün 2-3).

2. Sığır Beyin Kılcal Damarlarından Primer Perisitlerin İzolasyonu

1. 4. Gün: Kılcal damarları ışık mikroskobu altında inceleyin.
   not: Uygun miktarda perisit sağlamak için şişe şimdi yaklaşık% 60-70 oranında birleşmelidir (Şekil 1, gün 4). Eğer durum böyle değilse; GM'yi 10 mL taze ortamla değiştirin ve şişeyi bir gün daha inkübatörde bırakın.
2. Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS'de nazikçe yıkayın.
3. Endotel hücreleri için 2 mL çözülmüş Tripsin-EDTA ekleyin ve şişeyi inkübatörde 1-3 dakika bekletin. Matarayı sık sık çıkarın ve bu süre zarfında mikroskopla gözlemleyin.
   not: Endotel hücreleri yuvarlanmalı ve şişeden ayrılmalıdır; Perisitler, "hayalet" morfolojiye sahip hücreler olarak görünür olmalı ve yine de şişenin yüzeyine bağlı olmalıdır. Bu zor ve önemli bir adımdır.Perisit monokültürünün kontaminasyonunu önlemek için çoğu endotel hücresinin çıkarılması önemlidir, ancak uzun süreli tripsinizasyon da perisitleri ayırabilir. Tripsinizasyon süresi zaman zaman biraz değişebilir ve bu nedenle tedavi sırasında şişeyi mikroskopla sık sık gözlemlemek son derece önemlidir.
4. Gevşemiş endotel hücrelerini ayırmak için endotel hücreleri yuvarlanmaya başladığında şişeye hafifçe vurun.
5. Tripsinizasyonu durdurmak için, şişeye 10 mL DMEM-comp ekleyin. Endotel hücrelerini çıkarmak için şişeyi ortamla birkaç kez dikkatlice yıkayın. Endotel hücresi süspansiyonunu şişeden aspire edin. Endotel hücreleri artık başka amaçlar için de kullanılabilir.
6. Şişeye 10 mL DMEM-comp ekleyin. Perisitlerin hala mevcut olduğundan ve dibe bağlı olduğundan emin olmak için ışık mikroskobunun altına bakın. Perisit bakımından zenginleştirilmiş kültürün büyümesine izin vermek için şişeyi inkübatöre geri koyun.
   not: İlerleyen günlerde kültürü gözlemlemek önemlidir. Hala büyüyen yeterli sayıda endotel hücresi varsa, başka bir tripsin tedavisi uygulanabilir.
7. Perisit monokültürünün, her iki günde bir DMEM-bileşen ortamının değişmesiyle büyümesine izin verin. Işık mikroskobu altında hücrelerin büyümesini kontrol edin (Şekil 1, 5-8. gün).

Sonuçlar

Şekil 1: Kılcal damarların kültürü ve perisitlerin izolasyonu.Kılcal damarlar taze sığır beyninden izole edildi ve 0. günde kültür şişelerine ekildi. Sığır beyin kılcal damarlarından büyüme ve ardından perisitlerin izolasyonu günler boyunca ışık mikroskobu ile takip edildi. 4. gün, endotel hücrelerini çıkarmak için tripsin ile tedaviden önce endotel hücresi büyümesini gösterir ve 4b günü, tedaviden he...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pbs	Sigma Aldrich	D8537	Fosfat tamponlu tuzlu su
Kollajen IV	Sigma Aldrich	C5533
T-75 şişesi	Sigma Aldrich	CLS3972
Fetal sığır serumu (FBS)	PAA/GE Sağlık Hizmetleri	A15-101
Fibronektin	Sigma Aldrich	F1141
Tripsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
Işık mikroskobu	Olympus	Olympus CK2	Faz kontrastlı dik ışık mikroskobu
DMSO (Türkçe)	Sigma Aldrich	471267
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
Hücre inkübatörü	Termo Balıkçı
merkezkaç	Termo Balıkçı	Heraeus Multifuge 3SR+	Hücreleri döndürmek için standart büyük hacimli santrifüj
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartalları Orta	Sigma Aldrich	D0819
Penisilin G Sodyum / Streptomisin sülfat	Sigma Aldrich	P0781 Serisi
MEM esansiyel olmayan amino asitler	Sigma Aldrich	M7145

· Serisi · Serisi · Serisi · Serisi · Serisi dijital fotoğraf makinesi · · Serisi · Serisi · · Serisi