Serebral Kılcal Damarların İnsan Beyninden İzolasyonu: İnsan Beyin Dokusundan Serebral Kılcal Damarları Çıkarmak İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Hartz, A. M. S. et al. Taze İnsan Beyin Dokusundan Serebral Kılcal Damarların İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, taze bir insan beyin dokusundan serebral kılcal damarların izolasyonunu sunar. İzole edilmiş kılcal damarlar daha sonra bir ex vivo kan beyin bariyeri modeli oluşturmak için kullanılabilir.

Protocol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Beyin Örneği Hazırlama

NOT: Şekil 1A, aşağıda açıklanan tüm izolasyon prosedürünün iş akış şemasını göstermektedir. İnsan beyin dokusu korteksin herhangi bir yerinden kaynaklanabilir ve taze veya dondurulmuş olarak kullanılabilir. Donmuş beyin dokusu oda sıcaklığında çözülebilir (tampon yok; 10 g için ~ 30 dakika). Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, beyin dokusu her deney için aynı beyin bölgesinden elde edilmelidir. Bu protokol, dondurulmamış taze (Ölüm Sonrası Aralık veya PMI <4 saat) insan serebral korteksi için optimize edilmiştir.

1. İnsan beyin dokusunun hazırlanması: Beyin dokusunun ağırlığını belgeleyin. Aşağıdaki protokoldeki tüm sayılar 10 g taze insan beyin dokusu için uygundur. Beyin dokusunu 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Tüm meninksleri forseps ile dikkatlice çıkarın. Beyaz maddeyi kesmek için bir neşter kullanın.
2. İnsan beyin dokusunun kıyılması: Beyin dokusunu dikkatlice kesin ve bir neşter ile kıyın. Yaklaşık 5 dakika kıyın (2-3 mm'lik parçalar). Beyin dokusunu Potter-Elvehjem doku öğütücüsüne aktarın. 30 mL izolasyon tamponu ekleyin.
   not: Kıyma işlemi sırasında beyin dokusu lapa haline geldiği için kıyma dokusu parçalarının görülmesi zordur.

2. Homojenizasyon

1. Potter-Elvehjem doku öğütücü (boşluk: 150–230 μm): Her numuneyi 50 rpm'lik bir homojenizatör hızında 100 vuruşla homojenize edin. Her 25 vuruşta bir geçen süreyi ve 100 vuruş için gereken toplam süreyi belgeleyin. Önerilen bir homojenizasyon protokolü için Tablo 1'e bakınız; 10 g insan frontal korteksini homojenize etmek için toplam süre yaklaşık 22 dakikadır. Kabarcıkları önlemek için havayı karıştırmayın.
2. Dounce homojenizatör (boşluk: 80–130 μm): Homojenatı buz üzerinde bir Dounce homojenizatöre aktarın. Süspansiyonu 20 strokla homojenize edin (~6 s/strok, toplam ~2 dk). Baloncuklardan kaçının.

3. Santrifüjleme

1. Beyin homojenatını dört adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne eşit olarak dağıtın ve homojenatın toplam hacmini belgeleyin. Santrifüj tüplerine 50 mL yoğunluk gradyan tamponu dağıtın (tüp başına 12,5 mL). Havaneli ve homojenizatörü durulamak için 10 mL izolasyon tamponu kullanın ve dört santrifüj tüpüne dağıtın (tüp başına ~2,5 mL).
2. Santrifüj tüplerini kapaklarla sıkıca kapatın. Tüpleri kuvvetlice sallayarak homojenatı, yoğunluk gradyan ortamını ve tamponu karıştırın. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 5.800 x g'da santrifüjleyin (sabit açılı rotor); Peleti tüpe bağlı tutmak için orta bir yavaşlama hızı seçin. Süpernatanı atın ve her peleti 2 mL% 1 BSA'da yeniden süspanse edin.

4. Filtreleme

NOT: Kılcal damarları kırmızı kan hücrelerinden ve diğer hücre kalıntılarından ayırmak için birkaç filtreleme adımı gereklidir.

1. 300 μm ağ: Peleti yeniden süspanse ettikten sonra, süspansiyonu 300 μm ağdan süzün. Kılcal damarlar ağ boyunca süzülürken, daha büyük damarlar ve daha büyük beyin kalıntıları ağ üzerinde kalır. Ağı 50 mL'ye kadar %1 BSA ile dikkatlice yıkayın. Mesh.
   atın not: Bu filtrasyon adımı, kılcal süspansiyonu daha büyük damarlardan veya beyin kalıntıları parçalarından temizler.
2. 30 μM hücre gerinim filtresi
   not: Bu filtreleme adımı, kılcal damarları kırmızı kan hücrelerinden ve diğer beyin kalıntılarından ayırır.
   1. Adım 4.1'den itibaren kılcal süzüntüyü beş adet 30 μm hücre süzme filtresine (hücre süzme filtresi başına yaklaşık 10 mL kılcal süzüntü) dağıtın. Kılcal damarlar bu filtre tarafından tutulurken, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreler ve küçük beyin kalıntıları filtreden geçer ve süzüntüde toplanır.
   2. Her filtreyi 25 mL %1 BSA ile yıkayın. Daha sonra, verimi artırmak için tüm filtratları altıncı filtrenin üzerine dökün. Her filtreyi 50 mL %1 BSA ile yıkayın; Kılcal damarları içeren hücre suş filtrelerini tutun ve süzüntüyü atın.

5. Kılcal Damar Toplama

1. Filtreleri ters çevirin ve kılcal damarları her filtre için 50 mL %1 BSA ile 50 mL'lik tüplere yıkayın. 5 mL'lik bir pipetörün pipet ucuyla nazikçe basınç uygulayın ve beyin kılcal damarlarını yıkamak için filtrenin üzerinde hareket ettirin.
2. Tüm beyin kılcallarını, özellikle filtrenin kenarından yıkadığınızdan emin olun. Kabarcıklardan kaçının çünkü bu, filtreleme işlemini daha zor hale getirir ve kılcal damar kaybı olasılığını artırır.

6. Yıkama

1. Kılcal damarları topladıktan sonra, tüm numuneleri 1.500 x g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin (sallanan kova rotoru). Süpernatanı çıkarın ve peleti yaklaşık 3 mL izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Bir numuneden alınan tüm yeniden süspanse peletleri 15 mL'lik bir konik tüpte birleştirin ve izolasyon tamponu ile doldurun. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1.500 x g'da tekrar santrifüjleyin ve iki kez daha yıkayın.
2. Kılcal saflığı mikroskop (100X büyütme) ve kamera ile belgeleyin (Şekil 1B).
   not: 10 g insan beyin dokusundan elde edilen beyin kılcal verimi genellikle yaklaşık 100 mg'dır. İzole edilmiş beyin kılcal damarları artık deneyler için kullanılabilir, işlenebilir (örneğin, lizat, membran izolasyonu) veya en az 6-12 ay boyunca kriyotüplerde -80 ° C'de saklanabilir (çoklu donma-çözülme döngülerinden kaçının).

Vuruş	Saat
1–25	7–7,5
26-50	5–5,5
51–75	5–5,5
76–100	5–5,5
Toplam zaman:	22-24 dk

Tablo 1: Homojenizasyon protokolü. Potter-Elvehjem doku öğütücüsünün 10 g insan frontal korteksini 50 rpm'lik bir homojenizasyon hızında homojenize etmesi için homojenizasyon protokolü. İlk birkaç vuruşun kıyılmış dokuyu homojenize etmek için ek süre gerektirdiğini unutmayın. Bu ilk homojenizasyondan sonra, her strok 12 sn sürer (aşağı doğru hareket için 6 s, yukarı hareket için 6 s). Böylece, ilk homojenizasyondan sonra, 1 dakikada 5 vuruş veya 5 dakikada 25 vuruş gerçekleştirilebilir.

Results

Şekil 1: Kılcal izolasyon için akış şeması. (A) Piktogram, beyin kılcal damarlarını taze insan dokusundan izole etme prosedürünün ana adımlarını göstermektedir. (B) Resim, izolasyondan hemen sonra (100X büyütme) ışık mikroskobu altında izole edilmiş insan beyni kılcal damarlarını göstermektedir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kişisel Koruyucu Donanım (KKD)
Diamond Grip Plus Lateks Eldivenler, Microflex Medium	VWR, Radnor, PA, Amerika Birleşik Devletleri	32916-636	Ppe
Tek Kullanımlık Koruyucu Laboratuvar Önlükleri	VWR, Radnor, PA, Amerika Birleşik Devletleri	470146-214	KKD; insan kaynaklı materyalin doğası gereği, tek kullanımlık bir laboratuvar önlüğünün kullanılması önerilir
Yüz Siperi, tek kullanımlık	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	19460102	KKD; insan kaynaklı materyalin doğası gereği, tek kullanımlık bir yüz siperi kullanılması önerilir
Güvenlik Malzemeleri
Clavies Yüksek Sıcaklık Otoklav Torbaları 8 x 12	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	01-815-6
Versi Kuru Tezgah Kağıdı 18" x 20"	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	14-206-32	Çalışma alanlarını kapsayacak şekilde
VWR Kesici-Delici Konteyner Sistemleri	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	75800-272	Kullanılmış neşterler için
Çamaşır suyu %8.2 Clorox Antiseptik 64 oz.	Birleşik Krallık Tedarik Merkezi, Lexington, KY, ABD	323775
Ekipman
4 °C Buzdolabı	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Ölçüm Cihazı	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	AB15
Heidolph RZR 2102 Kontrolü	Heidolph, Elk Grove Köyü, IL, ABD	501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Santrifüj	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	75004521
Leica L2 Diseksiyon Mikroskobu	Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, Amerika Birleşik Devletleri		Meninksleri çıkarmak için kullanılır
POLYTRON PT2500 Homojenizatör	Kinematica AG, Luzern, İsviçre	9158168
Ölçek P-403	Denver Enstrümanı, Bohemya, NY, ABD	191392
Standart mini Karıştırma	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	1151050
Termo-Şişeler Sıvı Nitrojen Dewar	Termal Bilimsel, Mansfiled, TX, ABD	11-670-4C	Dokuyu dondurmak için kullanılır
Voyager Pro Analitik Terazi	OHAUS, Parsippany, NJ, Amerika Birleşik Devletleri	VP214CN
ZEISS Eksenel Mikrocope	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, Amerika Birleşik Devletleri		İzole edilmiş kılcal damarları kontrol etmek için kullanılır
Aletler ve Züccaciye
Finnpipet II Pipet 1-5 mL	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	21377823T1	Kılcal damarları filtreden yıkayın
Finnpipette II Pipet 100-1.000 μL	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	21377821T1	BSA'da peleti yeniden askıya alın
Pipet Çocuk	Integra, Hudson, NH, Amerika Birleşik Devletleri	739658
50 mL Falcon tüpleri 25 / raf - 500 / cs	VWR, Radnor, PA, Amerika Birleşik Devletleri	21008-951
EISCO Neşter Bıçakları	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	S95938C	Beyin dokusunu kıymak için
PARAFILM FILMI	VWR, Radnor, PA, Amerika Birleşik Devletleri	52858-000	Beher ve hacimsel şişeyi örtmek için
Thermo Scientific Finntip Pipet Uçları 5 mL	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	21-377-304	Filtredeki kılcal damarları yıkamak için
Luer-Lok ile 60 mL şırınga	Thermo Fisher Bilimsel, Pittsburgh, PA, ABD	BD309653	Kılcal damarları filtrelemek için konektör halkası ile birlikte kullanılır
Neşter Sapı #4	Güzel Bilim Araçları, Foster City, CA, ABD	10060-13	Kıyma için kullanılır
Dumont Forseps #5	Güzel Bilim Araçları, Foster City, CA, ABD	11251-10	Meninksleri çıkarmak için kullanılır
Potter-Elvehjem Doku Öğütücü	Thomas Bilimsel, İsveçli, NJ, Amerika Birleşik Devletleri	3,43E+28	50 mL hacim, boşluk: 150-230 μm
Dounce Homojenizatör	VWR, Radnor PA Amerika Birleşik Devletleri	62400-642	15 mL hacim, boşluk: 80-130 μm
Spektrum / Mesh Dokuma Filtreler (300 μm)	Spektrum Laboratuvarları, Rancho Dominguez, CA, ABD	146424	Kalabilecek meninksleri çıkarmak için kılcal süspansiyonu filtrelemek için kullanılır
pluriSüzgeçler (gözenek boyutu: 30 μm)	pluriSelect Yaşam Bilimleri, Leipzig, Almanya	43-50030-03
Bağlayıcı Halkası	pluriSelect Yaşam Bilimleri, Leipzig, Almanya	41-50000-03	Birden çok kez yeniden kullan
1 L hacimsel şişe			İzolasyon Tamponunun hazırlanması için
1 L beher			%1 BSA hazırlamak için
Karıştırma Çubuğu			% 1 BSA ve Ficoll® hazırlanması için
Schott Şişesi (60 mL)			Ficoll'un® hazırlanması için
Buz Kovası			Her şeyi soğuk tutmak için
100 mm Petri kabı			Beyin dokusunun kıyılması için
Doku Kültürü Hücre Sıyırıcı	VWR, Radnor, PA, Amerika Birleşik Devletleri	89260-222	Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarmak için
Kimyasallar
BSA Fraksiyonu V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	A9647-500g	DPBS'de bir gün önce Ca2 + ve Mg2 + ile hazırlanın. Hazırlık sırasında kabarcıklardan kaçının. Buzdolabında saklayın. Kullanmadan önce 10 dakika yavaşça karıştırın.
Ca2+ ve Mg2+ ile DPBS	Klon	SH30264. FS	DPBS - İzolasyon Tamponunun bir parçası
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	F4375	Burada kesin ölçüm önemlidir. Karıştırma çubuğu ile şişede tartın. DPBS'yi ekledikten sonra kuvvetlice çalkalayın. Buzdolabında O / N olarak saklayın. Sabah hava açık olacak. Kullanmadan önce 10-15 dakika hafifçe karıştırın. Kullanana kadar buz üzerinde tutun.
Glikoz (D-(+) Dekstroz)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	G7528	Glikoz (D-(+) Dekstroz) Konsantrasyonu: 5 mM
Sodyum Hidroksit Standart Çözelti	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	71474	DPBS'nin pH'ını ayarlamak için
Sodyum Pirüvat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	P2256	Konsantrasyon: 1 mM