Floresan Peptit Zimografi: Zymogram Jellerinde Florojenik Substratlar Kullanılarak Proteaz Aktivitesini Tespit Etmek İçin Modifiye Edilmiş Bir Teknik

Özet

Kaynak: Deshmukh, A. A. et al. Floresan Peptit Zimografi ile Proteaz Aktivitesinin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, biyolojik örneklerdeki proteolitik aktiviteyi analiz etmek için elektroforetik bir teknik olan zimografi uyguluyoruz.

Protokol

1. Peptit Zimografi Jellerinde Biyolojik Örneklerin Elektroforezi

1. Numuneleri geleneksel zimografi numune tamponunda çözün (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, %25 gliserol, %4 SDS, %0.01 bromofenol mavisi). Hücre ve doku örnekleri için, oyuk başına ~ 30 μg toplam protein ve MMP standartları için 50-100 ng protein önerilir.
2. Jel aparatına 400 mL 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer ekleyin. Kuyucuk başına 35 μL'ye kadar numune yükleyin. Numuneleri 1,5 saat boyunca veya moleküler ağırlık standartları, ilgilenilen proteazların peptit çözücü jel tabakası (görünür bir turuncu renge sahip) içinde olduğunu gösterene kadar 120 V'ta çalıştırın.
   not: Çoğu MMP ve varyantları 35-100 kDa aralığındadır. Moleküler ağırlık standartları, bu ağırlıkların peptit çözücü jel tabakası içinde olduğunu gösterdiğinde, elektroforez durdurulabilir. Aynı prensip, bilinen moleküler ağırlıklara sahip diğer proteaz sınıflarına da uygulanabilir. Daha geniş bir moleküler ağırlık aralığında birden fazla proteazı tespit etmeye ilgi varsa, çözücü jel tabakasının boyutunu küçültün ve peptit çözücü jel tabakasının boyutunu artırın.
3. Elektroforezi takiben, jelleri plastik kasetten çıkarın ve jelleri% 2.5 Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ ve 50 mM Tris-HCl, pH 7.5'te 5 mM CaCl₂ içeren renatüre edici tamponda hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
4. Jeleri, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 içinde 15 dakika boyunca% 1 Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ ve 5 mM CaCl₂ içeren gelişmekte olan bir tampon çözeltisine aktarın. Taze gelişmekte olan tampon çözeltisi ile değiştirin ve jelleri 37 ° C'de 24 saat boyunca hafif çalkalama altında inkübe edin, jellerin çözeltiye tamamen daldırıldığından emin olun.
5. 24 saat sonra, uygun uyarma ve emisyon filtrelerini kullanan bir floresan jel tarayıcı/görüntüleyici kullanarak görüntü jelleşir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mm Boş Jel Kasetleri	ThermoFisher Bilimsel	NC2015
%20 SDS Çözümü	Ambion Teknolojisi	AM9820
3x Zymography Örnek Tamponu	Biyo-Rad	1610764
Azido-PEG3-Maleimid Kiti	Kimya Araçları'na tıklayın	AZ107
PowerPac Temel Güç Kaynağı	Biyo-Rad	1645050
Precision Plus Protein Çift Renk Standardı	Biyo-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hipodermik İğneler	Balıkçı Bilimsel	14-826