Fokus Ultrason Tabanlı Mikrokabarcık Aracılı Kan-Beyin Bariyeri Açma: Sonoporasyon Yoluyla Farenin Kan-Beyin Bariyerinde Lokalize Geçici Açıklıklar Oluşturma Tekniği

Özet

Kaynak: Haumann, R. et al. Kemirgenlerde kan-beyin bariyerinin açılması için yüksek verimli, görüntü kılavuzlu stereotaktik nöronavigasyon ve odaklanmış ultrason sistemi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, mikro kabarcık aracılı odaklanmış ultrason (FUS) kullanarak geçici açıklıklar oluşturarak kan-beyin bariyerini (BBB) geçici olarak bozma yöntemi açıklanmaktadır. Bu geçici lokal BBB açıklıkları sonunda daha büyük boyutlu ilaç moleküllerini doğrudan beyin parankimine iletmek için kullanılabilir.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fokuslu Ultrason Sistemi

NOT: Açıklanan kurulum, ticari olarak temin edilebilen bileşenlere dayalı, şirket içi inşa edilmiş bir BBB bozulma sistemidir ve 3D baskılı özel yapım bir koni ve çıkarılabilir stereotaktik platform içerir. Sistem, mevcut ekipmana ve özel kullanıma göre modifikasyonları kolaylaştıran modüler olarak tasarlanmıştır. Protokol, fare beyninin pontin bölgesinde daha geniş bir alanın sonoporasyonu için prosedürü açıklar. Hedef konumu ayarlayarak, beynin farklı kısımları hedeflenebilir. Bu çalışmada, odak uzaklığı 75 mm, açıklık 60 mm ve odak alanı 1.5 x 1.5 x 5 mm (FWHM tepe basıncı) olan 1 MHz'lik tek elemanlı bir dönüştürücü kullanılmıştır. Dönüştürücünün odak düzlemi, hayvanın kafatası boyunca, kulak çubukları ile kesişen yatay düzlemde konumlandırılır.

1. Kemirgenlerde BBB açılması için uygun bir dönüştürücü seçin.
   not: Mikro kabarcıkların özelliklerine ve kullanılan frekansa bağlı olarak, akustik ayarlar, özellikle mekanik indeks (MI) değişebilir.
2. Dönüştürücüyü 3D baskılı koniye yerleştirin.
3. Işın yayılma yolunun akustik eşleşmesini sağlamak için koninin alt ucunda akustik olarak şeffaf bir mylar membran kullanın ve koniyi gazı alınmış su ile doldurun.
4. Dönüştürücüyü, Şekil 1'de gösterildiği gibi motorlu bir doğrusal kademe üzerine hayvanın üzerine monte edin ve dönüştürücünün otomatik olarak dikey konumlandırılmasına izin verin.
5. Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, sıcaklık ayarlı ısıtma, ısırma ve kulak çubukları, anestezi ve çok modaliteli referans belirteçleri içeren çalışmanın gereksinimlerine dayalı olarak çıkarılabilir bir stereotaktik platform tasarlayın. Stereotaktik platformun montajı, hayvanın kiriş altında hassas otomatik konumlandırılmasına (< 0,1 mm) izin veren bir 2D doğrusal aşama sisteminden oluşur.
6. Dönüştürücüyü, bir dönüştürücü, bir fonksiyon üreteci ve bir güç amplifikatöründen oluşan Şekil 1'de gösterilen akustik emisyon zincirine bağlayın.
7. Beynin ilgilendiği alanın hassas sonoporasyon hedeflemesine ve iğne hidrofonu tarafından algılanan kavitasyon verilerinin toplanmasına izin veren çok modaliteli referans belirteçlerini tespit etmek için bir görüntü işleme hattı tasarlayın.
8. Sistemi kalibre edin ve dönüştürücünün odak noktasını, hayvanın stereotaktik platform üzerindeki dikey konumuna uygun olarak belirleyin.

2. Hayvan Hazırlama

NOT: Aşağıdaki protokol fareler için belirtilmiştir ancak sıçanlar için uyarlanabilir. Bu deneyler için dişi athimik çıplak Foxn1-/- fareler (6-8 haftalık) kullanıldı.

1. Hayvanın hayvan tesisinde en az bir hafta iklimlendirmesine izin verin ve hayvanı düzenli olarak tartın.
2. Analjezik tedaviye başlamak için FUS tedavisinden 30 dakika önce deri altı (sc) enjeksiyon yoluyla buprenorfin (0.05 mg / kg) uygulayın.
3. Hayvanı% 3 izofluran, 2 L / dak O₂ ile uyuşturun ve hayvanın derin anestezi aldığını doğrulayın. Tüm prosedür boyunca hayvanları anestezi altında tutun ve izofluran konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlamak için solunum frekansını ve kalp atış hızını izleyin.
4. Kuru gözleri önlemek ve olası yaralanmaları önlemek için göz merhemi sürün.
5. Başın üst kısmındaki tüyleri bir tıraş bıçağı ve tüy dökücü kremle alın ve daha sonra cildi tahriş etmemek için kalıntıları gidermek için suyla yıkayın.
6. BLI tümör modelleri ile yapılan deneyler için, BLI görüntü rehberliği için 29G insülin şırıngası ile 150 μL D-lusiferin (30 mg / mL) intraperitoneal (ip) enjekte edin.
7. 26-30G'lik bir kuyruk ven kateteri yerleştirin ve kateteri ve veni küçük bir hacimde heparin solüsyonu (5 UI/mL) ile yıkayın. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için kateteri heparin solüsyonu ile doldurun.
   not: İyi bir kateterizasyon, kateter içine kan akışı olduğunda görülür. Emboliyi önlemek için kateterdeki hava kabarcıklarından kaçının. Aşırı enjeksiyon basıncından kaçınmak için, kateterin uzunluğunun mümkün olduğunca kısa olduğundan emin olun.
8. Hipotermiyi önlemek için hayvanı sıcaklık ayarlı stereotaktik platforma yerleştirin.
   not: Hipotermi, mikro kabarcıkların enjeksiyonunu / dolaşımını ve ilaçların farmakokinetiğini etkileyebilen kan dolaşımını azaltır.
9. Kulak çubukları ve bir ısırma çubuğu kullanarak hayvanın kafasını stereotaktik platformda hareketsiz hale getirin ve sabitleyin. Vücudu bir kayışla sabitleyin ve hayvanın kuyruğunu platforma bantlayın.

3. In Vivo Görüntü Kılavuzluğunda Fokuslu Ultrason

NOT: Bu protokol için, 10 ms süreli, 0,4 MI'lık ve 240 s boyunca 40 döngülü 1,6 Hz'lik bir ton patlaması darbesine sahip 1 MHz tek elemanlı bir dönüştürücü kullanıldı. Protokol, zararsız bir gaz olarak kükürt hekzaflorür (SF₆) içeren fosfolipidler tarafından stabilize edilen mikro kabarcıklar için optimize edilmiştir, bu sayede ortalama kabarcık çapı 2,5 μm'dir ve kabarcıkların %90'ından fazlası 8 μm'den küçüktür.

1. Stereotaktik platformu, monte edilmiş hayvanla birlikte görüntüleme modalitesine (örn. BLI veya X-ışını) yerleştirin ve hayvanın görüntüsünü (görüntülerini) alın.
2. Dönüştürücünün odak noktasına göre hayvanın konumunu işaretlemek için görüntü işleme boru hattı ile birlikte çok modaliteli referans işaretleyicileri kullanın.
3. Elde edilen X-ışını görüntüsünün üzerine bir beyin taslağı yerleştirerek veya tümörün merkezini belirlemek için BLI görüntülerini kullanarak hedef alanı belirleyin (Şekil 2). Beynin belirli bölümlerinin konumu, Paxinos Beyin Atlası'nda bregma ve lambda kafatası işaretleri referans noktaları olarak kullanılarak belirtilmiştir. Örneğin, pons lambdadan x=-1.0, y=-0.8 ve z=-4.5'te bulunur.
4. Ultrason jelinin solunumla çelişmesini önlemek için hayvanın burun deliklerini ve ağzını yapışkan bantla koruyun.
5. Hayvanın başının üstüne ultrason jeli uygulayın.
6. Hayvanların boynunun derisini geri çekin, iğne hidrofonunu ultrason jeli ile yağlayın ve iğne hidrofonunu oksipital kemiğin doğrudan yakınına yerleştirin.
7. Görüntü işleme hattını ve odak noktasını kullanarak dönüştürücüyü doğru konuma yönlendirin.
8. Önceden yapılandırılmış ayarları tüm bağlı cihazlara uygulayın ve ilgilenilen beyin bölgesini hedefleyin.
   not: Araştırma sorusuna bağlı olarak, tümör veya beyin bölgeleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi tek bir odak noktası veya hacimsel şekil olarak sonoporate edilebilir.
9. Mikro baloncukları üretici tarafından açıklandığı gibi etkinleştirin. 120 μL (5.4 μg) mikro kabarcıklardan oluşan bir bolus enjekte edin.
10. Kateterin açıklığını kontrol etmek için kuyruk ven kateterini salinle yıkayın.
11. Mikro kabarcıkları enjekte edin ve insonasyonu başlatın.
12. İğne hidrofonu ile mikro kabarcık kavitasyonunu kaydedin.
13. Sonoporasyondan sonra intravasküler kontrast madde veya ilaç uygulayın. Doz, zamanlama ve planlama, çalışmanın amacına ve ilaca bağlıdır.
    not: Evans mavisi, BBB açılmasını değerlendirmek için yaygın bir renk ajanıdır.
14. Hayvanı önceden belirlenmiş zaman noktasına kadar veya insancıl son noktadan önce izleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Odaklanmış ultrason kurulumu. (A) Odaklanmış ultrason kurulumunun şematik gösterimi. (B) Odaklanmış ultrason kurulumunun resmi. Sistem, otomatik 3D konumlandırma için ikinci bir 2D tabla üzerinde 1D lineer tabla üzerinde yukarıdan aşağıya monte edilmiş bir dönüştürücüden oluşur. Dönüştürücü, sesi hayvanın kafatasına ileten akustik olarak şeffaf bir mylar memb...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL luer kilitli şırınga	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	309628	Plastipak Kumaş
19 G iğne	Terumo Agani ·	8AN1938R1
23 G iğne	Terumo Agani ·	8AN2316R1
3M Transpore cerrahi bant	Hayata uygulanan bilim	7000032707	Veya benzeri
Keyfi dalga formu üreteci	Siglent (Türkçe)		SDG1025, 25 mHz, 125 MSa/sn
Otomatik stereotakt	Şirket içi inşa		Tüm unsurları ile stereotact şirket içinde inşa edildi
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker		Yazılım içerir
Tamponlu NaCl çözeltisi	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
Buprenorfin hidroklorür	Bireysel İngiltere sınırlı		0.324 mg
Kafes zenginleştirme: kağıt hamuru akıllı ev	Biyo hizmetler
Karbon filtre	Bickford Belediyesi	NC0111395	Omnicon f/hava
Seramik kaşık
Pamuklu çubuklar
D-lusiferin, potasyum tuzu	Altın Biyoteknoloji	ŞANS-1
etanol	VUmc eczanesi		%70
Evans Mavisi	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl %0,9	Fresenius Kabi		Nacl %0.9, 1000 mL
Histoakril	Braun Cerrahi		Histoakril 0.5 mL
Hidrofon	Hassas Akustik
İnsülin şırıngası	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	324825/324826	0.5 mL ve 0.3 mL
İzofluran	TEVA İlaç BV	8711218013196	250 mL
Ketamin	Alfasan A.Ş.		%10, 10 mL
Fare maması: Teklad global %18 proteinli kemirgen diyeti	Envigo (Envigo)	2918-11416 milyon
Neoflon kateter	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	391349	26 GA 0,6 x 19 mm
Osiloskop	Keysight teknolojileri		Infiniivision DSOX024A
Plastik tüpler	Greiner biyo-bir	210261	50 mL
Güç amplifikatörü	Elektronik ve İnovasyon Ltd	210 litre	Modeli: 210L
Ön amplifikatör DC Bağlayıcı	Hassas Akustik		Seri numarası: DCPS94
makas	Sigma Aldrich	S3146-1EA	Veya benzeri
Sedazin	AST Farma		%2
SonoVue mikro kabarcıkları	Bracco (Beşiktaş)		8 μl/mL
Steril su	Fresenius Kabi		1000 mL
şırınga			Çeşitli şırıngalar kullanılabilir
Temgesic (Temgesic)	Bireysel İngiltere sınırlı		0.3 mg / mL
Dönüştürücü	Hassas Akustik		1 mhz
cımbız	Sigma Aldrich	F4142-1EA	Veya benzeri
Ultrason jeli	Parker Laboratuvarları A.Ş.	01-02	Aquasonic 100
Vidisik jel	Bausch + Lomb		10 gr

Serisi · Serisi · Serisi · Serisi