In Utero Elektroporasyona Dayalı Gen Dağıtımı: Murin Embriyolarının Embriyonik Serebellar Hücrelerine Plazmid DNA Enjekte Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Feng W. et al. In Utero Elektroporasyon Tabanlı Gen Transferi Kullanılarak Serebellar Granül Hücrelerinde CRISPR Aracılı Fonksiyon Kaybı Analizi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, plazmid DNA'nın in utero elektroporasyon kullanılarak murin embriyolarının serebellar nöronal hücrelerine verilmesini göstermektedir. Bu yöntem, normal beyin gelişiminde genlerin in vivo fonksiyonunu ve tümör ilerlemesi sırasında nöron hücrelerinin gen ekspresyonundaki değişiklikleri anlamak için yararlıdır.

Protokol

1. In Utero Elektroporasyon Gerçekleştirin

1. 6 ila 8 haftalık fareleri yetiştirin ve aletleri utero elektroporasyon için hazırlayın. Erkek homozigot Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP farelerini dişi CD-1 fareleri ile çaprazlayın. Vajinal tıkaç tespit edildiği günden itibaren CD-1 farelerinin hamileliğini zaman ayırın (E0.5). Embriyolar E13.5 gününde elektroporasyona tabi tutulur.
   1. Borosilikat cam kılcal damarları (iç çap: 0,6–0,8 mm) bir mikropipet çekiciyle çekin. Aşağıdaki ayarları kullanın: P = 500, Isı = 560, Çekme = 150, Vel = 75, Zaman = 250. Enjeksiyon sırasında daha iyi görselleştirme için kılcal ucu siyah mürekkeple etiketleyin. Bir cetvel ve keskin iğne cımbızı kullanarak kılcal konikliği bir stereomikroskop altında kesin ve ucu yaklaşık 6 mm uzunluğunda kesin.
   2. Deneyin tekrarlanabilir olmasını sağlamak için kılcal damarların birliğini koruyun. Kırpma sırasında tek taraflı eğimli bir kenar oluşturun. Rahim duvarının kolay nüfuz etmesi ve embriyonun doku hasarını önlemek için uç mümkün olduğunca keskin olmalıdır.
      not: Alternatif olarak, 35°'lik bir açıyı ayarlamak için bir mikro öğütücü kullanın. Kılcal damarlar oda sıcaklığında 10 cm'lik bir petri kabında patojen içermeyen koşullarda saklanabilir.
   3. Cerrahi aletleri otoklavlayın.
   4. SgRNA-plazmitleri eşit parçalar halinde pT2K-IRES-Luc ile her plazmit için en az 1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona kadar karıştırın ve plazmit çözeltisini hızlı yeşil ile renklendirin (nihai konsantrasyon %0.05). Endotoksin içermeyen damıtılmış su ile %1 hızlı yeşil stok çözeltisi hazırlayın ve çözeltiden boya parçacıklarını çıkarmak için 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
      not: pT2K IRES-Luc'un birlikte transfeksiyonu isteğe bağlıdır, ancak biyolüminesans görüntüleme kullanılarak doğumdan sonra canlı elektroporasyonlu hayvanların tanımlanmasına izin verir. Ameliyat edilecek toplam hamile fare sayısı için yeterli miktarda plazmid karışımı hazırlayın. Fare başına yaklaşık 15-20 μL karışım kullanın (~ 12 embriyo). Hemen ameliyata devam edin.
2. Fareleri ameliyat için hazırlayın
   1. Hamile CD-1 farelerini izofluran ile uyuşturun. Anesteziyi %3-4 hacimce izofluran (oksijen akış hızı: 1,5 L/dk) içeren bir kutuda indükleyin ve ameliyat sırasında burun konisi yoluyla %2 hacimce koruyun.
      not: Ameliyatın tamamı 30 dakikadan uzun sürmemelidir. Gerekirse enjekte edilen ve elektropore edilen embriyoların sayısını azaltın. Ameliyat için steril eldiven kullanın.
   2. Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine sırt üstü yerleştirin ve anesteziyi ayarlayın.
   3. Analjezik enjekte edin (Metamizol, 800 mg / kg vücut ağırlığı, deri altı (s.c.), 24 saat depo).
      not: Metamizol dışında başka yetkili analjezikler de kullanabilirsiniz.
   4. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün.
   5. Uzuvları bantla sabitleyin ve karnı bir dezenfektanla sterilize edin. Fareyi gazlı bezle örtün ve yalnızca cerrahi alanı açıkta bırakın. Cerrahi alana ve gazlı beze% 70 etanol yayın.
   6. Yaklaşık 2 cm uzunluğunda bir cilt kesisi yapın ve boşluğu düz cerrahi makasla nazikçe genişletin. Linea alba'yı bulun ve künt uçlu doku makası kullanarak peritondan biraz daha küçük ikinci bir kesi yapın.
   7. Açılan karın boşluğunu önceden ısıtılmış steril 1x PBS ile nemlendirin.
   8. Halka forseps kullanarak uterus boynuzlarını karın boşluğundan dikkatlice çıkarın. Rahim duvarını yalnızca iki komşu embriyonun yumurta sarısı keseleri arasındaki boşluktan tutarak nazikçe çekin. Embriyoyu kesiden çekerken üzerine herhangi bir baskı uygulamaktan kaçının. Gerekirse kesiyi genişletin ve uterus arterinden kan akışını sıkıştırmadan uterus boynuzlarını karın üzerine yerleştirmek için ekstra özen gösterin.
      not: Bazı durumlarda, ikinci rahim boynuzuna geçmeden önce bir seferde bir rahim boynuzunun çıkarılması ve değiştirilmesi tavsiye edilir.
3. Plazmid DNA'ların enjeksiyonu ve elektroporasyonu
   1. Hazırlanan cam kılcal damar ile yaklaşık 15 μL renkli plazmid solüsyonunu aspire edin. Bu işlem sırasında herhangi bir hava kabarcığından kaçının.
      not: Plazmid çözeltisi, konsantrasyonu yüksekse ucu kolayca tıkayabilir. Enjeksiyondan hemen önce bir miktar DNA salarak kılcal damarı test edin.
   2. Embriyoyu halka forseps ile nazikçe tutun ve boyun bölgesini bulun.
      not: Embriyo enjekte edilmesi zor bir konumdaysa, atlayın ve bir sonraki embriyoya geçin. Embriyonun artan yeniden konumlandırılması, onlara zarar verme olasılığını artırabilir.
   3. Önceden hazırlanmış cam kılcal damarın ucuyla, dorsal arka beyinden nüfuz ederek dördüncü ventriküle yavaşça delin ve ardından yaklaşık 1 μL plazmit karışımı enjekte edin. Boyanmış DNA'nın beyinden sızmadığını ve elmas şeklinde bir yapı olarak görünür olduğunu onaylayın.
      not: Bir seçenek olarak, dördüncü ventrikülün ve çevresindeki kan damarlarının daha iyi görselleştirilmesi için 2,5 kat büyüteç kullanın. Plazmid çözeltisinin diğer ventriküllere difüzyonunu önlemek için enjeksiyondan hemen sonra elektrik darbeleri verin.
   4. Forseps benzeri platin cımbızla elektrikli kare darbeler (5 darbe, 32 mV, 50 ms-açık, 950 ms-kapalı) uygulayın (bkz. Elektrotları, kulağı kaplayan negatif kutup ve serebellar primordiumda bulunan pozitif kutup uterus duvarı üzerinde olacak şekilde lateral olarak yerleştirin. E13.5 embriyolarının etkili elektroporasyonu için 5 mm çapında elektrot plakaları kullanın.
      not: Baraj başına toplam embriyo sayısının 2 /^3'ünden daha azını manipüle ederek yavruların hayatta kalma oranını artırın. Rahim ağzına çok yakın embriyolardan kaçının. Manipüle edilirlerse, doğum sırasında komplikasyonlara neden olabilirler ve tüm çöpü tehlikeye atabilirler. Elektrotlar embriyonun kalbine çok yakınsa, bu kalp durmasına neden olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Otoklav bandı	Kisker Biyoteknoloji	150262
Elektro Kare Poratör	BTX (Türkçe)	ECM830
Endofree Maxi Kit	Keçi	12362
etanol	Merck	107017
Göz merhemi (Bepanthen)	Bayer	81552983
Hızlı Yeşil	Merck	104022
Filtre (0,22 μm)	Merck	F8148
Forseps düz	Güzel Bilim Araçları	91150-20
Gazlı bez (X100 ES-pedler 8f 10 x 10 cm)	Balıkçı Bilimsel	15387311
Filamentli Cam Kılcal	Narishige (Narishig)	GD1-2
Isıtma yastığı	Termo Lüks	463265 / -67
İzofluran	Zoetis Belediyesi	TU061219
Yüzük Forseps	Güzel Bilim Araçları	11103-09
Stereomikroskop	Nikon	C-PS (Bilgisayar-Devre
Cerrahi makas	Güzel Bilim Araçları	91460-11
Künt uçlu cerrahi makas	Güzel Bilim Araçları	14072-10
Cımbız, 5 mm disk elektrotlu Platin	Xceltis GmbH	CUY650P5
Metamizol	WDT (Radyo Frekansı
Non-Steril İpek İplik (0.12 mm)	Güzel Bilim Araçları	18020-50
PBS (1 adet)	Yaşam Teknolojileri	14190169
Mendil makası Kör (11,5 cm)	Güzel Bilim Araçları	14072-10
pCAG-EGxxFP	Ekle	50716
pX330 plazmit	Ekle	42230

Serisi Serisi arası )