Murin Perineural İnvazyon Modeli: Fare Siyatik Sinirinde Perinöral İnvazyonu Simüle Etmek için İn Vivo Model Oluşturma

Özet

Kaynak: Deborde, S. et al. Perineural İnvazyonun İn Vivo Murin Siyatik Sinir Modeli. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, pankreas kanseri hücrelerini siyatik sinire enjekte ederek perinöral invazyon için in vivo bir fare modeli geliştiriyoruz. Bu model, invazyonun derecesini ölçmeye ve kanser hücreleri ile sinirler arasındaki etkileşimleri incelemeye yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Farelerin Hazırlanması ve Ameliyat

NOT: Bu çalışmada 8 haftalık, erkek ve dişi C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Ameliyat koşulları kurumumuzun IACUC kurallarına uygundur. Aletler sterilize edilir, cerrahi çalışma yüzeyi dezenfekte edilir, hayvan dezenfekte edilir ve cerrah steril eldiven giyer.

1. Ameliyattan bir gün önce, fareyi %2 izofluran kullanarak uyuşturun ve ardından ince bir tıraş bıçağı veya kimyasal bir epilasyon maddesi ile sırt tarafındaki uyluk kemiği boyunca kürkü çıkarın.
2. Ameliyat günü, fareleri bir indüksiyon odasında% 2 izofloran kullanarak uyuşturun. Anesteziyi bir ayak parmağı sıkıştırma uyarıcısı ve yanıt eksikliği ile onaylayın.
3. Anestezi altında kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün.
4. Anestezi uygulanmış fareyi ventral tarafına yerleştirin ve enjekte edilecek uzuvda hafif bir gerginlik oluşturmak için her bir uzvu hipoalerjenik bantla nazikçe sabitleyin. Anestezi, hassas bir buharlaştırıcı ve burun konisi ile verilen izofluran kullanılarak sürdürülür.
5. Enjeksiyon bölgesini Betadine ile temizleyin, ardından tekrar% 70 alkol ile temizleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Ameliyat alanında gevşek saç kalmadığından emin olun.
6. Femurun yaklaşık 2 mm altında ve paralel olarak küçük bir makasla 1 cm'lik bir kesi yapın. Altındaki kasları ortaya çıkarmak için cildi forseps ile yanlamasına geri çekin.
7. Siyatik sinir, gluteus maximus ve biceps femoris kaslarına kadar derinlemesine uzanır. Bu iki kası küçük bir makasla fasyal bir düzlem boyunca ayırın ve altındaki siyatik siniri ortaya çıkarın. Künt diseksiyon kullanarak siniri çevredeki kaslardan kurtarın.
8. Peletten 3 μL kanser hücresi (yaklaşık 50.000 hücre) 10 μL'lik bir şırıngaya çekin.
   not: Alternatif olarak, kontrol olarak 3 μL PBS çizin.
9. Destek için enjeksiyon noktasında sinirin altına küçük bir metal spatula yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu ile görüntüleme altında, iğneyi yerleştirildikten sonra sinire mümkün olduğunca paralel tutarak metal tabana karşı sinirin içine sokun. Sinirin arkasından delinmemeye dikkat edin. Bu süreç boyunca sinirin işlenmesini mümkün olduğunca en aza indirin.
10. 5 saniye boyunca yavaşça sinire enjekte edin. Enjeksiyon alanında bir ampul oluşumu, iyi bir enjeksiyonu gösterir. Ardından, iğneyi nazikçe çıkarmadan önce iğneyi 3 saniye yerinde bırakın. İğneyi 3 saniye boyunca yerinde tutmak, hücrelerin sinirden geri akışını en aza indirir.
    not: Enjeksiyon distal sinire veya omuriliğe doğru yapılabilir. Bir dizi deney içinde tutarlı kalmak önemlidir. Hücreler dışarıya dökülürse, hayvan deneyin analizine dahil edilmemelidir. Tecrübe ile bu olaylar çok nadirdir.
11. Siniri orijinal konumuna geri getirin. Siniri üstteki kaslarla örtün. Fareleri uygun analjezi ile tedavi edin ve ardından cildi 5-0 Naylon dikişlerle kapatın.
12. Fareyi, anesteziden tamamen uyanana kadar iyileşme sırasında gözlem yapmak için tek başına temiz bir kafese koyun.
    not: Hayvanın tam bilincini geri kazanması 5-15 dakika sürer. Hayvan, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmaz. Hayvan, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmez. Daha sonra, iyileşmeyi 72 saat boyunca en az 24 saatte bir değerlendirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
fare			Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak değişken sayı ve yaş
Elektrikli tıraş makinesi	Ayhan	9962	Ticari epilasyon maddesi ile ikame edilebilir
İzofluran, 250 mL	Baxter	1001936060
Hipoalerjenik cerrahi bant	3M Blender	70200419342
Betadine Takas Çubukları	Pdı	Ürün Kodu: 41350
Webcol Alkol Hazırlıkları	Covid (Türkçe)	5110
Steril cerrahi aletler (makas ve forseps)
10 μL Hamilton şırınga	Hamilton	80308
Çelik Mikro spatula	Balıkçı Bilimsel	S50823 Serisi
Diseksiyon mikroskobu
Bupivacine, 1 g	Enzo Yaşam Bilimleri	BML-NA139-0001	% 0,5'e yeniden oluşturun
5-0 Naylon sütür	Etik	698H

Serisi