$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Siyatik Sinir Ekstraksiyonu
- Siyatik sinirlerine daha önce kanser hücreleri enjekte edilen fareleri alın ve onları CO2 ile ötenazi yapın. Fareyi ventral tarafına yerleştirin ve pimleri kullanarak distal uzuvları stabilize edin.
- Enjekte edilen uzuv ve gövdenin sırt tarafındaki cildi çıkarın.
- Künt diseksiyon kullanarak, siyatik siniri kasların derinliklerine maruz bırakın.
- Sinir, ilium ve sakrum arasında seyreder. Omurilik bölgesindeki sinire erişmek için iki kemiği ayırın. Öncelikle siyatik sinirin bulunduğu dar alana kapalı makası sokun ve ardından fareyi tutarken makası açın. Diseksiyon sırasında hassas olun ve siyatik sinirin bütünlüğünü koruyun.
- Siyatik siniri distal olarak uyluk kemiğinin sonuna ve omuriliğe proksimal olarak dikkatlice inceleyin.
not: İstila edilen sinirler son derece kırılgandır ve gerilim veya zorla kullanım altında kırılmaya eğilimlidir.
- Önce distal ucunu keserek siniri hasat edin. Bitişik dokudan serbest bırakırken siniri dikkatlice kaldırın. Siniri proksimal uçta, omurgadan çıkışına mümkün olduğunca yakın bir yerde kesin.
- Daha sonra bir Sürmeli kumpas kullanarak brüt istila uzunluğunu kaydedin. Bu makroskopik tahmin sadece gösterge niteliğindedir.
2. Sinir İşleme ve Kantitifikasyon
- Diseke edilmiş siniri OCT bileşiğine gömün. Sinirleri kalıbın altına uzunlamasına ve mümkün olduğunca düz bir şekilde yerleştirdiğinizden emin olun.
- Kasette sinirin proksimal ve distal tarafını P (Proksimal ) ve D (Distal) harflerini işaretleyerek belirtin.
- Gömülü sinirleri, hemen kesilmezlerse kuru buzun üzerine yerleştirin. Numune birkaç hafta boyunca -80 ° C'de korunabilir.
- 5 μm kalınlığında bir Kriyostat mikrotomu kullanarak kesit numuneleri alın ve kesitleri cam slaytlar üzerine yerleştirin. Mümkünse, slayt başına iki sinir bölümü yerleştirin. Sinirin proksimal tarafını belirtin.
- H & E boyama kullanarak slaytları boyayın.
- Yüksek çözünürlüklü dijital veriler sağlayan bir slayt tarayıcı ile lekeli sinir bölümlerini dijital olarak tarayın.
- Görüntüleme yazılımını kullanarak, mesafeyi ölçme düğmesine, istila alanına veya istenen diğer parametrelere tıklayarak istila uzunluğunu ölçün. İnvazyon uzunluğunun iyi bir tahmini için, aynı sinirin birden fazla bölümünü (2 ila 4) kullanın.