Tümör Hücrelerinin Zebra Balığı Embriyolarına Uzun Süreli Ortotopik Nakli: Tümör Hücresi Davranışının Uzun Süreli Analizi için Tümör Hücrelerini Zebra Balığı Embriyolarının Dördüncü Ventrikülüne Vermek İçin Etkili Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Casey, M. J. et al. Zebra Balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin, Tümör Hücresi Davranışı ve İlaç Yanıtının Uzun Süreli Çalışması için Bağışıklığı Yetkin Konakçılara Nakli.J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, zebra balığı beyin tümörü hücrelerinin, immünokompetan bir zebra balığı embriyosunun dördüncü ventrikülüne ortotopik transplantasyonunu göstermektedir. Bu prosedür, tümör hücresi istilası ve davranışının uzun süreli çalışmasına izin verir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Tümör Süspansiyonunun 2-dpf Embriyonun Dördüncü Ventrikülüne Enjekte Edilmesi

1. 10-20 anestezi uygulanmış dekoryonlu embriyoyu bir transfer pipeti kullanarak enjeksiyon plakasının çevresine aktarın; embriyolar, ventriküller açıkça görülebilecek ve erişilebilir olacak şekilde enjeksiyon plakasına yanal olarak düşmelidir. Embriyoları gerektiği gibi ayarlamak için açılı bir prob kullanın ve bunları enjeksiyon plakasının dış kenarından uzağa yerleştirin.
2. Jel yükleme pipet uçlarını kullanarak enjeksiyon iğnesine 1-2 μL tümör hücresi süspansiyonu yükleyin ve iğneyi manipülatöre yerleştirin.
3. İğneyi 45°'lik bir açıyla tutarak manipülatörü manuel olarak indirin. Mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri, iğne embriyo başının hemen üzerinde ve yaklaşık 5 mm sağında olana kadar x, y ve z yönlerinde ayarlayın. Stereomikroskobun göz merceklerinden bakın ve iğne embriyonun dördüncü ventrikülünü delene kadar mikromanipülatörü x yönünde yavaşça ayarlayın. İğnenin kalbi veya yumurta sarısını delmesine izin vermeyin.
   1. Tümör hücresi süspansiyonunu enjekte etmek için mikroenjektöre bağlı ayak pedalına basın.
      not: Enjeksiyon basıncı ve süresi, iğne deliği boyutuna göre değişecektir, ancak iyi bir başlangıç noktası 5-10 PSI ve 50-100 ms'dir. Enjekte edilen tümör hücrelerinin hacmi, istenirse mineral yağa enjeksiyon yoluyla standart yağ damlası teknikleriyle değerlendirilebilir. 0,1 mm'lik bir damla çapına sahip 500 pL'lik enjeksiyonlar tipik olarak en iyi sonuçları verir.
4. Enjekte edilen embriyoları enjeksiyon plakasından nazikçe durulayın ve taze yumurta suyu (ters ozmoz suyunda 0.6 g / L akvaryum tuzu + 0.01 mg / L metilen mavisi) kullanarak bir Petri kabına koyun. Embriyoları kalan prosedürler için veya tanklarda büyüyene kadar yumurta suyunda tutun.
5. Enjekte edilen embriyoları bir floresan stereomikroskop altında inceleyin. Enjeksiyon basıncının, açısının, iğne boyutunun ve hücre süspansiyon viskozitesinin, tümör hücrelerinin ventrikül boşluğunun %25-50'sini doldurmasına neden olduğunu doğrulayın. Bu parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
6. Kalan embriyolar için 1.1–1.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Ek embriyoları gerektiği gibi uyuşturun.
   not: Deneyimli bir kullanıcı 3-4 saat içinde 300'e kadar embriyo enjekte edebilir.
7. Embriyoları gece boyunca 28 ° C inkübatöre geri yerleştirin.
8. Ertesi gün, tarif edildiği gibi normal kalp ve beyin gelişimi gibi morfolojik ve fizyolojik özellikleri inceleyerek embriyo sağkalımını değerlendirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yumurta suyu	Evde		Embriyoların bakımı, enjeksiyon plakası yapılması
Petri kabı	Termo Balıkçı	FB0875711Z	Embriyoların barındırılması, enjeksiyon plakasının yapılması
Cam Kap	Herhangi bir ticari marka		Enjeksiyon plakası yapmak
Mikropipetler	Herhangi bir ticari marka		Tümör resüspansiyonu ve transplantasyonu
Açılı Prob	Güzel Bilim Araçları	10140-02	Embriyo manipülasyonu
Transfer Pipeti	Herhangi bir ticari marka		Embriyo manipülasyonu
Stereomikroskop	Olympus	SZ61	Tümör nakli
Floresan Stereomikroskop	Olympus	SZX16	Tümör nakillerinin görüntülenmesi
Mikroskop Kamerası	Olympus	DP-72	Tümör nakillerinin görüntülenmesi
kuvöz	Herhangi bir ticari marka		Embriyoların korunması, enjeksiyon plakasının ısıtılması
N2	Herhangi bir ticari marka		Mikroenjektör kurulumu için
Cam kılcal damar (filament yok)	Dünya Hassas Aletler	TW120-4	Tümör nakli
İğne çektirme	Sutter Aletleri	P-97	Tümör nakli
Mikro yükleyici ipuçları	Eppendorf Belediyesi	930001007	Tümör nakli
Mikro enjektör	Harvard Aygıtı	PLI-90	Tümör nakli
Trikain-S (MS-222)	Batı Kimya	TRS1	Tümör nakli, anestezik
agaroz	Denville	CA3510-8	Enjeksiyon plakası yapmak
mikrodalga	Herhangi bir ticari marka		Enjeksiyon plakası yapmak
ölçeklemek	Herhangi bir ticari marka		Enjeksiyon plakası yapmak
eldivenler	Herhangi bir ticari marka		Protokolün tüm yönleri
Pronaz	Roche Diagnostik	11459643001	Dekoryonat embriyoları
Tıraş bıçağı	Termo Balıkçı	12640	İğne hazırlama
50 mL beher (2 inç çapında)	Herhangi bir ticari marka		Enjeksiyon plakası yapmak
Cam Kap	Herhangi bir ticari marka		Enjeksiyon plakası yapmak
Metilen Mavisi	Sigma-Aldrich	M9140	Mantar büyümesini önlemek için yumurta suyuna ekleyin

Serisi Serisi Serisi Serisi Uçağı Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi