Murin Modelinde Terapötik Nöral Kök Hücrelerin (NSC'ler) İntranazal Dağıtımı: Onkolitik Virüs Yüklü NSC'lerin Beyin Tümörü Taşıyan Fare Modeline Tümör Hedefli Verilmesi İçin Bir Prosedür

Bu makalede

Özet

Kaynak: Yu, D. et al. Bir fare modelinde terapötik kök hücrelerin glioblastoma intranazal iletimi. J. Vis. Uzm.(2017)

Bu video, onkolitik virüs yüklü terapötik nöral kök hücrelerin beyin tümörü taşıyan bir fare modeline intranazal iletimini göstermektedir. Kök hücrelerin non-invaziv intranazal uygulaması, kan beyin bariyerini atlayarak, terapötik uygulamalar için beyindeki tümör bölgesine verilmelerini kolaylaştırır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. İnsan NSC'lerinin Hipoksik Ön Koşullandırılması (Şekil 1A)

T75 kültür şişelerinde plaka kültürlü NSC'ler,% 90 birleşmeye ulaşılana kadar şişelenir.
Hücre kültürü şişelerini, otomatik bir yerleşik akış ölçer tarafından kontrol edilen N 2 gaz beslemesi aracılığıyla, 24 saat boyunca% 1 O₂ seviyeleri korunan nemlendirilmiş bir CO₂ odası / inkübatörü içine yerleştirin. Bu hücreler ^HNSC'ler olarak adlandırılır. Kontrol ^NNSC'ler şu şekilde oluşturulur:
1. İnsan NSC'lerini (klon HB1.F3.CD) %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM ortamında% 95 oda havası ve% 5 CO₂ altında nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatörde koruyun.

2. İnsan NSC'lerinin Onkolitik Virüs ile Yüklenmesi (Şekil 1B-1H)

^NNSC'leri, ^HNSC'leri 50 koşullu replikatif adenovirüs (CRAd)-S-pk7 viral partikülü/hücresi ile enfekte edin.
Periyodik dokunma ile oda sıcaklığında 2 saat inkübasyondan sonra, bağlanmamış viral partikülleri çıkarmak ve hücreleri enjeksiyon için steril salin içinde askıya almak için hücreleri ortamla üç kez yıkayın.
Dikkat: Virüsle ilgili tüm in vitro hücre kültürü prosedürlerini BSL2 gibi uygun biyogüvenlik seviyesi tanımına sahip tesislerde gerçekleştirin. Onkolitik virüsü ele alan araştırmacılar tarafından kurumsal hayvan tesisi yönergelerine göre uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.

>3. Terapötik NSC'lerin intranazal uygulaması (Şekil 1D ve Şekil 2D)

NSC'leri kültürleyin ve toplayın (^NNSC'ler, ^HNSC'ler).
Prosedüre göre bir ketamin ve ksilazin karışımının i.p. enjeksiyonu ile fareleri uyuşturun:
1. Onaylanmış reaktifleri kullanarak hayvanı vücut ağırlığına göre uyuşturun, yani ketamin (50-100 mg / kg; onaylanmış doz aralığı için kurumsal IACUC'a danışın) ve ksilazin (5-10 mg / kg; onaylanmış doz aralığı için kurumsal IACUC'a danışın) 200-250 μL steril salin içinde, veya bir inhalasyon cihazı kullanılarak% 4-5 izofluran anestezisi yoluyla.
Vücut ısısını korumak için fareleri, altında bir ısıtma yastığı bulunan yukarı bakacak şekilde temiz bir örtü üzerine yerleştirin. Farenin başının altına yerleştirildiğinde burun deliklerinin dik açısını sağlamak için bantlarla sarılmış kağıt havlulardan yapılmış yastıklı bir yastık ayarlayın.
Bir mikropipet kullanarak, farenin her burun deliğine 2 μL NSC süspansiyonu dağıtın. Bir sonraki fareye geçmeden önce damlacığın aspirasyonunu görsel olarak onaylayın. Teslim edilen toplam hücre sayısı kullanıcı tarafından belirlenebilir; 62.500-125.000 hücre / μL kullanın, böylece 0.5-1 milyon hücre 4 x 2 μL'lik dozlarda verilebilir.
Her hücre süspansiyon uygulaması arasında 4 defaya kadar 5 dakikalık aralıklar sağlamak için bir zamanlayıcı kullanın.
Hayvanların, sırtüstü pozisyon boyunca korunarak bir kurtarma odasında hareket kabiliyetini yeniden kazanmalarına izin verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: İntranazal doğumdan önce yer alan genel kök hücre hazırlama prosedürleri için bir akış şeması. (A-C) CXCR4'ü aşırı eksprese etmek için kök hücrelerin hipoksik ön tedavisi veya genetik modifikasyonları. (B-D) Yıkama, enzimatik ayrışma, hücre toplama ve sayma aşamaları, kök hücrelerin terapötik veya tanısal kargo ile müteakip yüklenmesi için gerçekleştirilir. <...