Mikrotümörlerin Oluşturulması: İlaç Tedavisine Yanıtı Analiz Etmek İçin 3D Mikrotümörleri Kültürlemek İçin İn Vitro Kültür Tekniği

Özet

Kaynak: Gilbert, A. N. et al. Kinomik Profilleme ve İlaç Yanıt Testi için 3D İnsan Biyojel Kültür Sistemi ve Hasta Kaynaklı Glioblastoma Hücreleri Kullanılarak Mikrotümörlerin Oluşturulması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, 3D insan biyojeli kullanarak hastadan türetilen tümör hücrelerinden mikrotümörler üretiyoruz. Bu mikrotümörler, in vivo tümör mikroçevresine çok benzer ve ilaç testi için potansiyel platformlar olarak hizmet eder.

Protokol

1. Mikrotümör Oluşumu

1. Reaktiflerin Hazırlanması
   1. Tam NBM hazırlamak için 500 mL'lik bir şişe Neurobazal Media'ya (NBM) aşağıdakileri ekleyerek tam NBM'yi hazırlayın: A vitamini içermeyen 10 mL B-27 takviyesi, 5 mL N2 takviyesi, 100 μL EGF, 100 μL Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF)-Bazik, 5 mL amfoterisin B, 0.5 mL gentamisin, 5 mL L-glutamin ve nötralize Yüksek Yoğunluklu insan biyojeli (HuBiojel) (3 mg / mL'de HDHG) iç protokol başına hazırlayın. Benzer biyojel matrisleri de kullanılabilir.
2. Mikrotümör Üretimi ve Kültürü
   1. Buz üzerinde tam NBM'de tek hücreli süspansiyon olarak yeni ayrışmış PDX hücreleri elde edin.
   2. Hücre süspansiyonunu eşit hacimde tripan mavisi çözeltisi (PBS'de% 0.4) ile karıştırın ve tripan mavisi dışlaması ile hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için hemositometre kullanarak analiz edin. Hacim = (50.000 hücre/tümör * # tümör)/(canlı hücre sayısı / 1 mL) olan 50.000 hücre/mikrotümör oluşturmak için gerekli hacmi çıkarın ve yeni bir konik tüpe yerleştirin.
   3. Hücreleri, oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleme ile konsantre edin. Süpernatanı atın ve hücre peletini buz gibi soğuk HDHG çözeltisi ile FBS'de 1 kısım hücre ve 4 kısım HDHG'de nihai oranda yeniden süspanse edin.
   4. Mikrotümörler (her biri 50.000 hücre içeren 2 mm'lik boncuklar) oluşturmak için 96 pinli bir çelik plakaya (hidrofobik kaplamalı) pin başına 10 μL dağıtmak için elektronik çok kanallı bir pipet kullanın.
   5. Boncukları jelleştirmek için 3D tümör boncuklarını doku kültürü inkübatörünün (37 °C, %5 CO₂, nemlendirilmiş) içine 15 dakika yerleştirin.
   6. Jelleşmeden sonra, mikrotümörleri (10 μL) elektronik çok kanallı pipet ve özel pin cihazı kullanarak özel bir süspansiyon kültür odasına (50 mL) veya tam NBM içeren büyük hacimli kültür kabına (10 cm) aktarın.
   7. Doku kültürü inkübatöründe 1-2 gün sonra, mikrotümörleri geniş ağızlı bir dağıtım pipeti kullanarak 50 μL NBM/kuyucuk içeren 96 oyuklu kültür plakalarına aktarın ve çeşitli tahlil ve analiz protokolleri uygulayın.
3. Mikrotümörlerin İlaç Tedavisi ve Bakımı
   1. Uyuşturucu testi için nihai konsantrasyonları seçin.
      NOT: İlacın 2D kültürde bilinen etkinliği varsa, orta doz konsantrasyonu olarak IC50'nin 2 katını seçin ve toplam 5 doz seviyesi için yukarıda ve aşağıda 3 kat seri seyreltme seçin. Örneğin, IC50, 2D kültürde ilaç için 9 μM ise, ilaç testi için nihai konsantrasyon olarak 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM ve 162 μM seçin.
   2. Dimetil sülfoksit (DMSO) stoğundan tam NBM'de 2x ilaç dozlama çözeltisi hazırlayın. 5 doz, 3 katlı seri seyreltme hazırlamak için dozlama çözeltisini% 1 DMSO ortamında seyreltin.
   3. % 0.5'lik bir nihai DMSO konsantrasyonu elde etmek için tahlil plakalarında 50 μL içeren mikrotümör kuyucuğuna 50 μL doz çözeltisi ekleyin. Her kopya için tekrarlayın (ör., 4) adım 1.3.1'de belirlenen her ilaç dozunda.
   4. Kültürleri 37 °C, %5 CO₂, nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 1-14 gün koruyun. Kültürleri haftada iki kez, yukarıdaki gibi canlandırıcı ortam ve ilaç çözeltisi ile besleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kollajenaz-I	Sigma-Aldrich	CO130
Nörobazal-A	Yaşam Teknolojileri	10888-022
N-2 Takviyesi	Yaşam Teknolojileri	17502-048	1x son konsantrasyon
A Vitamini İçermeyen B-27 Takviyesi	Yaşam Teknolojileri	12587-010	1x son konsantrasyon
Rekombinant İnsan FGF-temel	Yaşam Teknolojileri	PHG0266	10 ng/mL nihai konsantrasyon
L-Glutamin	Corning Cellgro Medya Teknolojisi	25-005-CI	2 mM nihai konsantrasyon
Gentamisin	Yaşam Teknolojileri	15750-060	50 ng/mL nihai konsantrasyon
Tripan Mavisi	Pierce Termo Bilimsel	15250-061
Yüksek Yoğunluklu Hubiogel	Vivo Biyobilimler	HDHG-5
DMSO (Türkçe)	balıkçı	BP231	Kalsein ve bileşiklerinin çözünmesi için
Dulbecco'nun Ca/Mg İçeren Fosfat Tamponlu Salin	Corning Cellgro Medya Teknolojisi	20-030-Özgeçmiş	MiliQ ultra saf su ile 1 kata kadar seyreltilmiş (ön fiksasyon yıkaması için)
% 10 Nötr Tamponlu Formalin	protokol	032-060
100 mm cam petri kapları	balıkçı	08-748D

Gazetesi Teknolojisi Serisi Serisi