SB Aracılı Transpozisyon Kullanılarak Glioblastoma İndüksiyonu: SB Plazmidinin Yenidoğan Fare Beynine Transpozon Aracılı Entegrasyonu Kullanılarak Yeni Fare Modeli Oluşturmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Calinescu, AA ve ark. Yeni Glioblastom Modelleri Oluşturmak için Plazmid DNA'nın Yenidoğan Farelerin Subventriküler Bölgesine Transpozon Aracılı Entegrasyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak glioblastomları (GBM) indüklemek için etkili bir teknik açıklanmaktadır. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histopatolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

Protokol

1. İntraventriküler Neonatal Enjeksiyonlar

1. Deneyden üç ila dört hafta önce, bir erkek ve bir dişi fare ve plastik renkli bir iglo ile bir fare yetiştirme kafesi kurun. Bu, zenginleştirilmiş bir ortam sağlar ve çiftleşme sürecine yardımcı olur.
2. Hamilelik onaylandığında, erkeği yeni bir kafese çıkarın. Çiftleşmeden on sekiz gün sonra, teslimat için kafesi günlük olarak izleyin. Doğum sonrası 1. günde (P1) intraventriküler enjeksiyonlar yapın.
3. Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması.
   NOT: Enjeksiyon çözeltisi, transfeksiyon için parçacıkları oluşturmak için plazmit DNA'nın transfeksiyon reaktifi ile karıştırılmasıyla yapılır. Aşağıda, Uyuyan Güzel transpozaz ve lusiferazı kodlayan bir plazmit kullanılarak bir enjeksiyon çözeltisinin hazırlanmasına ilişkin bir örnek verilmiştir: pT2/SB100x-Luc ve iki transpozon plazmiti: pT/CAGGS-NRASV12 ve pT/CMV-SV40-LgT, 1:2:2 oranında. Tüm plazmitlerin konsantrasyonu 2 μg/μL'dir.
   1. 4 μg (2 μL) pT2/SB100x-Luc, 8 μg (4 μL) pT/CAGGS-NRASV12 ve 8 μg (4 μL) pT/CMV-SV40-LgT ve 10 μL %10 glikoz ekleyerek DNA çözeltisini hazırlayın.
   2. PEI çözeltisini, %5'lik bir nihai konsantrasyona 2.8 μL in vivo jet PEI, 7.2 μL steril su ve 10 μL %10 glikoz ekleyerek hazırlayın.
   3. PEI çözeltisini DNA çözeltisine ekleyin, karıştırın ve girdap yapın ve 20 dakika oda sıcaklığında (RT) bekletin. Çözelti artık enjeksiyona hazırdır. RT'de bir saat sonra, çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   4. 10 ° eğimli 30G hipodermik iğne ile donatılmış 12.5 μL'lik temiz bir şırıngayı mikro pompaya yerleştirin (Şekil 1 #1).
4. Enjeksiyon sisteminin düzgün çalıştığını doğrulamak için, şırıngaya 1 μL su çekmek için otomatik enjektörü (Şekil 1 # 10) kullanın ve ardından şırıngayı tamamen boşaltın.
5. Yenidoğan stereotaksik aşamasını (Şekil 1 # 3) kuru buz ve alkol bulamacı ile 2-8 ° C'ye kadar soğutun.
6. Yavruları 2 dakika boyunca ıslak buz üzerine yerleştirerek anesteziyi indükleyin. İşlemin geri kalanında anestezi, soğutulmuş stereotaksik çerçeve üzerinde devam edecektir. Çerçevenin sıcaklığının donma noktasının üzerinde, 2–8 °C arasında tutulması, termal yanık yaralanmalarını önleyecektir. Özel bir önlem olarak, yavrular ıslak buz üzerine yerleştirilmeden önce gazlı bezle sarılabilir.
7. Şırıngayı DNA / PEI çözeltisi ile doldurun.
8. Yavruyu stereotaksik çerçevede, başını gazlı bezle kaplı kulak çubuklarının arasına yerleştirerek hareketsiz hale getirin (Şekil 1b). Kafatasının sırt tarafının yatay, çerçevenin yüzeyine paralel olduğundan ve kraniyal dikişlerin açıkça görülebildiğinden emin olun. Kafayı% 70 etanol ile silin.
9. Şırınganın iğnesini indirin ve iğne lambdaya (parietal ve oksipital kemiklerin orta hat kesişimi) temas edene kadar stereotaksik çerçevenin kadranlarını kullanarak stereotaksik koordinatları ayarlayın (Şekil 1b).
10. İğneyi kaldırın ve stereotaksik koordinatları lambdaya 0.8 mm yanal ve 1.5 mm rostral olarak ayarlayın (Şekil 1b).
11. İğneyi cilde dokunana ve hafifçe çukurlaşana kadar indirin. Koordinatları ölçün. İğneyi 1,5 mm daha indirin. İğne cildi ve kafatasını delecek ve korteksten geçerek lateral ventriküle girecektir (Şekil 1c).
12. Otomatik enjektörü kullanarak, 0,5 μL/dk oranında 0,75 μL DNA/PEI çözeltisi enjekte edin.
13. Solüsyonun ventriküllere dağılmasını sağlamak için yavruyu bir dakika daha çerçeve üzerinde tutun. Bu arada, bir sonraki enjeksiyona hazırlanmak için başka bir yavruyu 2 dakika buz üzerinde uyuşturun.
14. İğneyi nazikçe ve yavaşça kaldırın ve yavruyu bir ısıtma lambasının altına yerleştirin. Solunum ve aktiviteyi izleyin. Gerekirse, ilk solunum gerçekleşene kadar uzuvların nazikçe uyarılmasını sağlayın.
15. Yavruyu ısındıktan, pembe bir renge ulaştıktan, düzenli nefes alıp verdikten ve aktif olduktan sonra, normalde 5-7 dakika annesine geri verin. Bir seferde birden fazla yavru enjekte edilirse, tüm enjeksiyonlar tamamlanana kadar tüm yavruları bir arada tutun. Enjeksiyonlar 30 dakikadan uzun sürerse, yavruların yarısını ilk 30 dakikadan sonra, geri kalanını ise işlemin sonunda geri koyun.
16. Barajın yavrularına duyarlı ve besleyici olduğunu izleyin. Gerekirse, kafese bir vekil anne ekleyin.
17. Yavruyu buza yerleştirme ile ısıtma lambasının altına yerleştirme arasındaki sürenin 10 dakikadan az olduğundan emin olun. Prosedür ne kadar hızlı olursa, sağkalım o kadar iyi olur. Genellikle, bir yavruyu uyuşturmak ve enjekte etmek için geçen süre 4 dakikadır.

Sonuçlar

Şekil 1: Yenidoğan farelerde intraventriküler enjeksiyonlar için deney düzeneği ve kılavuzlar. (bir)Mikrometre kadranlı bir stereotaksik çerçeve (2), 10 μl'lik bir şırınga (4) tutan otomatik bir enjektör ile donatılmıştır. U çerçevesinin içinde, bir yenidoğan adaptör çerçevesi güvenli bir şekilde sabitlenmiştir (3). Otomatik enjektörün (1) kontrol paneli, şırınga, hacim ve akış hızını...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Stoelting'in Sıçan ve Fare Adaptörleri ile Laboratuvar Standardı	Çalmak	51670	Diğer şirketler de benzer çerçeveler üretir, bunlardan herhangi biri küçük fare adaptörleri ile uygundur
Özetin Özeti Stereotaksik Enjektör (QSI)	Çalmak	53311	Enjeksiyonlar onsuz yapılabilir, ancak otomatik enjektör daha fazla tekrarlanabilirlik ve rahatlık sağlar
10 μL 700 serisi el tipi MİKROLİTE şırınga	Hamilton	Tip 701	Bu şırınga modeli, 0,5 ila 500 μL çözeltiyi güvenilir bir şekilde sağlayacaktır. Diğer şırıngalar da (örneğin 5 μL, Model 75) kullanılabilir
30 gauge hipodermik iğne (1.25", 15^{o} eğim)	Hamilton	S/O# 197462	Bu iğne, diğer invaziv prosedürlere ihtiyaç duymadan yenidoğan bir farenin derisini ve kafatasını delmek için idealdir. Donuklaşırsa (cilde kolayca girmezse), değiştirilmesi gerekir.
İn vivo jet PEI	Polyplus Transfeksiyon	201-10G	Küçük hacimlerde alikot yapın ve -20ºC'de tutun
D-Luciferin, Potasyum Tuzu	Goldbio.com	ŞansK-1g	Diğer ateşböceği lusifierase kaynakları da aynı derecede yeterlidir
Hematoksilen Çözeltisi, Harris Modifiye Edilmiş	Sigma Aldrich	HHS128-4L