$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Diseksiyon
>NOT: Damarlar hücre kültürü amacıyla kullanılmadığı sürece steril koşullar gerekli değildir. İzolasyon kabı çözeltileri hazırlayın: B1, 150 mL HBSS'ye 1.5 mL HEPES 1M ekleyin; B2, 20 mL B1'e 3.6 g Dekstran ekleyin; B3, 100 mL B1'e 1 g BSA ekleyin.
- 20 mL B1 ile 150 mL'lik bir beher hazırlayın. Hava kirlenmesini önlemek için buz üzerinde tutun ve parafilm ile örtün.
- Fareyi, kafese eklenen 1 mL saf İzofluran içine batırılmış küçük bir kağıt havluyla bir başlık altında derinlemesine uyuşturun. Anestezi, bir ayak parmağı tutamına reaksiyon eksikliği ile doğrulanır. Fareyi servikal çıkık ile öldürün.
not: Bu adımlar ulusal ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilir.
- İsteğe bağlı: Kan içeriğini ortadan kaldırmak için 20 mL PBS 1x ile intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
- Cildi bir neşter ile boynundan burnuna kadar kesin ve çekin. PBS 1x ile kirletici tüm tüyleri temizleyin.
- Kafatasını açmak için önce koku alma ampulünün önüne makas sokun ve kafatasını iki parçaya ayırmak için makası açın.
- Bir beyin spatulası kullanarak beyni dikkatlice çıkarın. Kan damarı hazırlığını kontamine edeceği için koroid pleksusu lateral ventriküllerden çıkarın.
not: İsteğe bağlı: Son hazırlık, parankimal ve meninks damarlarını içerecektir. İstenmezse meninksler soyulabilir.
- Beyni, buz üzerinde B1 çözeltisi içeren behere aktarın. En fazla 8 beyin birlikte tedavi edilebilir.
2. Beyin Dokusu Homojenizasyonu
- İki neşter kullanarak, beyni B1 çözeltisinde manuel ve kuvvetli bir şekilde dövün, ardından yaklaşık 2 mm'lik küçük parçalar elde edin.
- Preparatı, 400 rpm'de 20 vuruş gerçekleştiren otomatik bir Dounce homojenizatör ile homojenize edin. Hava ceplerinin oluşmasını önlemek için cam tüpün buzda tutulduğundan ve yukarı ve aşağı hareket ederken douker'ın üst kısmının çözelti içinde olduğundan emin olun. Birkaç numune hazırlanırsa, her homojenizasyon arasında douuncer'ı iyonize su ile yıkayın.
3. Gemi Saflaştırma
- Homojenatı 50 mL'lik bir plastik tüpe aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjlemeye devam edin. Damar peletinin üstünde büyük beyaz bir arayüz (çoğunlukla miyelin) oluşacaktır (perfüzyon yapılmadıysa kırmızı).
- Süpernatanı atın. Kap peleti ve beyaz arayüz birbirine bağlı kalacaktır. 20 mL buz gibi soğuk B2 solüsyonu ekleyin ve tüpü 1 dakika boyunca manuel ve kuvvetlice çalkalayın.
- 4,400 ° C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da ikinci santrifüjlemeye devam edin. Miyelin şimdi süpernatantın yüzeyinde yoğun beyaz bir tabaka oluşturacaktır.
- Tüpü tutarak ve süpernatantın duvarlar boyunca geçmesine izin vermek için yavaşça döndürerek miyelin tabakasını tüp duvarlarından dikkatlice ayırın. Miyelini süpernatan ile atın. Kapları içeren pelet, tüpün dibinde bağlı kalır.
- Tüpün iç duvarını 5 mL'lik bir plastik pipetin etrafına sarılmış emici bir kağıtla kurulayın ve kalan tüm sıvıları çıkarın, kap peletine dokunmaktan kaçının. Kalan sıvıyı boşaltmak için tüpü emici bir kağıt üzerinde baş aşağı tutun.
- Düşük bağlayıcı uçlarla yukarı ve aşağı pipetleyerek, tüpü buz üzerinde tutarak peleti 1 mL buz gibi soğuk B3 solüsyonunda askıya alın, ardından 5 mL başka bir B3 solüsyonu ekleyin. Gemilerin mümkün olduğunca dağıldığından ve agrega oluşturmadığından emin olun.
4. Filtreleme
- 30 mL buz gibi soğuk B3 çözeltisi ile buz üzerinde bir beher hazırlayın. Hava kirlenmesini önlemek için parafilm ile örtün.
- 20 μm gözenekli bir filtreyi, bir becker şişesinin üstündeki modifiye edilmiş bir filtre tutucusuna yerleştirin ve 10 mL buz gibi soğuk B3 solüsyonu uygulayarak dengeleyin.
- Kap hazırlığını filtrenin üzerine dökün ve kapları 40 mL buz gibi soğuk B3 solüsyonu ile durulayın.
- Temiz forseps kullanarak filtreyi geri kazanın ve hemen B3 solüsyonunu içeren behere daldırın. Kapları hafifçe sallayarak filtreden ayırın.
- Beher içeriğini 50 mL'lik bir plastik tüpe dökün ve 2,000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
not: Alternatif olarak, beyin damarlarının 3.6. adımdan itibaren süspansiyonu 100 μm'lik bir filtreye filtrelenebilir. Bu durumda, daha büyük kaplar tercihen filtre üzerinde tutulurken, akış daha sonra yukarıdaki gibi 20 μm'lik bir filtre üzerinde filtrelenen mikro damarlar (esas olarak kılcal damarlar) içerir.
- Mikro damar peletini 1 mL buz gibi soğuk B3 solüsyonunda yeniden süspanse edin ve 1.5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne pipetleyerek aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin.