Yöntem makalesi

İn Vitro Fagositoz Testi: Gerçek Zamanlı Astrosit Aracılı Sinaptozom Fagositozunu İncelemek İçin Canlı Görüntüleme Tabanlı Bir Yöntem

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Byun, YG, Chung, WS target="_blank">pH İndikatörü Konjuge Sinaptozomlar Kullanılarak Astrosit Aracılı Fagositozun Yeni Bir İn Vitro Canlı Görüntüleme Testi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, saflaştırılmış astrositlerin fagositik kapasitesini canlı görüntüleme testi ile in vitro olarak değerlendiriyoruz. Test, astrositlerin fagositik kapasitesini artırabilen veya inhibe edebilen kimyasal bileşikleri tanımlamak için etkili bir tarama platformu görevi görür.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fagositoz Canlı Görüntüleme Testi (Şekil 1)

  1. Astrositlerin birleştiği 24 oyuklu bir plaka (veya canlı görüntüleme için hazırlanmış herhangi bir plaka / tabak) hazırlayın (genellikle, saflaştırmadan sonra 7 ila 10 günlük inkübasyon hücreleri stabilize etmek için idealdir).
  2. Her bir oyuktaki ortamı çıkarın ve kuyucukları üç kez 1 mL Dulbecco'nun fosfat tampon salini (DPBS) ile yıkayın. Hava maruziyetini en aza indirmek için kuyuları hızlı bir şekilde yıkayın.
  3. 5 μL pH indikatörü konjuge sinaptozomlar ve glial hücre fagositozunu modüle edebilen immünopanlı astrosit şartlandırılmış ortam (IP-ACM) gibi ek faktörler ile 300 μL immünopanlı astrosit bazik ortamı (IP-ABM) ekleyin.
  4. Plakayı bir CO2 inkübatörde 40 dakika inkübe edin. Bu adım, pH indikatörü konjuge sinaptozomların plakaların dibine yerleşmesini sağlar.
  5. Bağlanmamış pH indikatörü konjuge sinaptozomları olan ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu 1 mL DPBS ile üç kez yıkayın.
    Dikkat: Sert bir şekilde yıkamayın. Hava maruziyetini en aza indirmek için kuyuları hızlı bir şekilde yıkayın.
  6. Kuyucuklara test etmek için ek faktörlerle birlikte 500 μL IP-ABM ekleyin.
  7. Plakayı canlı bir görüntüleme cihazına götürün ve konumları seçin. Odağı, pozlama süresini, parlaklığı ve LED gücünü ayarlayın.
    not: Pozlama süresi, parlaklık ve LED gücü ayarları, floresan yoğunluğuna ve deneyin amacına bağlı olarak değişkendir. pH indikatörü konjuge sinaptozomlarla yapılan canlı görüntüleme testinde, bu değerleri genellikle şu şekilde ayarlarız: maruz kalma: ~150–200 ms, parlaklık: 15 ve LED gücü: 4–6.
  8. Canlı görüntüleme için görüntü formatını, zaman aralığını ve toplam döngü sayısını ayarlayın. Kaç konumun seçildiğine bağlı olarak zaman aralığını 1 veya 2 saate ayarlayın. Canlı görüntüleme için 150'den fazla konum seçildiğinde 2 saatlik aralıklar önerilir.
  9. Canlı görüntüleme deneylerine başlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1. Fagositoz canlı görüntüleme testinin şeması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pHrodo kırmızısı, süksinimidil ester Köstebek probları P36600 SerisipH indikatörü konjugasyonu için
Fetal sığır serumu (FBS) Gibco (Gibco)16000-044
DMEM (Ömer ÇiçeğGibco (Gibco)11960-044
dPBS (dPBS)Welgene (Türkçe) LB001-02
Fagositoz canlı görüntüleme testi
Juli sahnesi NanoEntek
Zaman Serisi Çözümleyicisi V3 eklentileri https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html
Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Astrosit FagositozuSinaptozom zolasyonupH ndikat r AnaliziFloresan MikroskobuAstrosit K lt rSinaptozom Ba lanmasFagozom Olu umuGer ek Zamanl G r nt leme

İlgili makaleler