Civciv Embriyo Serebellar Dilimlerinin Ex Vivo Elektroporasyonu: Granüler Hücre Gelişimini Görselleştirmek için Yeşil Floresan Proteini Kodlayan Plazmid DNA'yı Tanıtma Yöntemi

Özet

Kaynak: Hanzel, M. et al.Civciv serebellar dilimlerinin ex vivo kültürü ve granül hücre öncüllerinin uzamsal olarak hedeflenmiş elektroporasyonu.J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda civciv embriyo serebellum dilimlerinin raportör gen plazmitleri ile elektroporasyonunu gerçekleştiriyoruz. Teknik, granül tabaka oluşturmak için granül hücre öncülerinin gelişiminin ve göçünün görselleştirilmesini kolaylaştırır.

Protokol

1. Dilimlerin Elektroporasyonu

1. Bir elektroporatörün anotunu yalıtım bandı ile 60 mm'lik bir Petri kabının tabanına sabitleyerek bir elektroporasyon odası oluşturun. Elektrodu kaplamak için yaklaşık 1 mL HBSS ekleyin.
2. HBSS ile kaplanmış elektrotun üzerine 0,4 μm'lik bir kültür eki yerleştirin. Uç ile elektrot arasında her zaman temas olduğundan emin olarak kültür ekinin elektrot üzerinde durmasına izin verin.
   not: Bu kurulumda, dilimlerle birlikte kültür eki, devreyi koruyarak ancak katodun uzamsal hedeflemesine izin vererek çözeltinin yüzeyine dayanacaktır.
3. Belirlenen dilimleri (kültür eki başına beşe kadar) kesilmiş uçlu 3 mL Pasteur pipeti kullanarak kültür ekine aktarın. Ayırın ve sagital oryantasyonda kültür ekine yerleşmesine izin verin.
4. Bir pipet kullanarak, fazla HBSS'yi çıkarın, böylece dilimler artık çözelti içinde yıkanmaz.
5. Bir P10 pipet ucu kullanarak, bir dilimin hedeflenen bölgesinin yüzeyi üzerinde %20 hızlı yeşil ile seyreltilmiş pipet DNA'sı (1 μg/μL konsantrasyonda). %20 hızlı yeşil, viskoz DNA çözeltisi sağlar ve DNA'nın çok geniş dağılmasını önler. Her dilime yaklaşık 5 μL DNA/hızlı yeşil çözelti ekleyin (Şekil 1B).
6. Katodu istenen hedeflenen dokunun üzerine yerleştirin ve 3 x 10 V, 10 msn süreli darbelerle elektropore edin. Katodun doku ile doğrudan temasından kaçının. Bunun yerine, iletkenliği korumak için sıvının yüzey geriliminden yararlanın (katodu dokuya gerçekten dokunmadan dokuya mümkün olduğunca yakın yerleştirin).
7. Her bir serebellar dilimde istenildiği gibi EGL'nin birden fazla bölgesine DNA iletimini ve elektroporasyonu tekrarlayın.
8. Elektroporasyonun tamamlanmasının ardından, kültür ekini 30 mm'lik Petri kabına aktarın.
9. Her kültüre 1 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin (Bazal Orta Kartal,% 0.5 (a / h) D- (+) - glikoz,% 1 B27 takviyesi, 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin) kültür ekinin altına, kültür eki ortamla temas edecek şekilde ekleyin, ancak dilimler içinde yıkanmaz.
10. Kültürleri 37 °C /% 6 CO_2'de 3 güne kadar inkübe edin. Tüm kültür ortamını her 24 saatte bir önceden ısıtılmış taze ortamla değiştirin.
11. Kültürü takiben, dilimleri kültür ortamı olmayan 30 mm'lik taze bir tabakta %4 paraformaldehit (veya 4 ° C'de O/N) içinde 1 saat boyunca kültür eklerine sabitleyin.

Sonuçlar

Şekil 1. Elektroporasyon odası kuruldu. (A) Özel yapım elektroporasyon odasının bir resmi. Oda, 60 mm'lik bir Petri kabının tabanına güvenli bir şekilde yerleştirilmiş bir elektroporatör anotundan oluşur. Çanak, elektrodu kaplamak için yaklaşık 1 mL HBSS içerir. Kültür eki, insert ile elektrot arasında sürekli temas olacak şekilde elektrot üzerinde durmalı, devreyi ko...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bazal Orta Kartal (Gibco)	Yaşam Teknolojileri	41010-026
L-glutamin	Sigma	G7513
Penisilin / Streptomisin	Sigma	P4333 Serisi
0,4 μm kültür eki	Kırlangıç	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne elektroporatör	Intracel	01-916-02	Elektroporasyon için 3 x 10 V 10 msn darbeleri kullanın.

Serisi