$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Beyincik Diseksiyonu ve Kesit Hazırlama (Uygulamalı Süre ≈ hayvan başına 15-20 dakika)
- Buz gibi soğuk diseksiyon ortamını içeren 60 mm'lik hücre kültürü kaplarından birini binoküler mikroskobun altına yerleştirin ve üst plakayı çıkarın.
- Baş kürkünü %70 etanol ile temizleyin (hayvanın gözlerine dokunmaktan dikkatlice kaçının) ve onaylanmış prosedüre göre büyük keskin makas kullanarak hayvanın kafasını kesin.
NOT: Serebellar dilimler, herhangi bir spesifik cinsiyet veya suş yanlılığı olmaksızın P9-P10 farelerinden üretilir.
- Cildi boynundan başlayıp fare ağzına kadar başın orta hattı boyunca kesmek için küçük bir makas kullanın.
- Kafayı tutmak ve kafatasını ortaya çıkarmak için, cildi başın altında ventral olarak geriye katlayın ve iki deri kıvrımını parmaklarınızın arasına sıkıştırın.
- Küçük makası nazikçe foramen magnumun içine sokun ve yana doğru bir yanal kesi yaparak kafatasını kesin ve ardından kafa kafatasının etrafını kesin. Beyin dokusuna zarar vermemek için makasın ucunu kesim sırasında kafatasına mümkün olduğunca paralel ve yakın tutun.
- İnce düz forseps kullanarak kafatasının dorsal kısmını alın. Kafatasının sırt kısmını dikkatlice kaldırırken, beyin dokusuna zarar vermemek için gerekirse yapışan meninksleri (beyin dokusunu çevreleyen yarı saydam irrigated zar) küçük makaslarla kesin.
- Ventral kafatası ile beyin arasına dikkatlice ince düz forseps sokun, beyni nazikçe dışarı çevirin ve optik ve trigeminal sinirleri küçük bir makasla kesin.
- Beynin yerçekimi ile buz gibi diseksiyon ortamı içeren 60 mm'lik hücre kültürü kabına, tabağın hemen üzerinde başı ters çevirerek düşmesine yardımcı olun ve gerekirse küçük bir makasla son yapışıklıkları serbest bırakın.
- İnce forseps kullanarak, beyni, sırt tarafı araştırmacıya bakacak ve ventral taraf yemeğin dibinde yatacak şekilde yönlendirin.
- Binoküler mikroskop altında, ön beyin tarafındaki beyni hareketsiz hale getirmek için ince düz forsepsleri kullanın ve hasar görebileceğinden arka beyne dokunmaktan kaçının. İnce düz forseps kullanarak arka beyni beynin geri kalanından ayırın (ön ve orta beyin, Şekil 1Aa'daki şemaya bakınız). Beyinciğini arka beynin geri kalanından ayırmak için, beyinciğin altındaki beyincik pedinküllerini kesmek için ince forsepsleri kullanın (Şekil 1Aa'daki şemaya bakın).
- Beyincik izole edildikten sonra, ince düz forseps kullanarak meninksleri dikkatlice yırtın (Şekil 1Aa'daki şemaya bakınız).
- Beyinciği ince kavisli forseps ile nazikçe tutun ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde doğrayıcı tıraş bıçağına dik olarak plastik platforma yerleştirin (Şekil 1Bb'deki şemaya bakın).
- 1 mL'lik bir pipete uyarlanmış steril bir ince uçlu pipet ucu kullanarak beyincik etrafındaki fazla diseksiyon ortamını aspire edin (Şekil 1Bb'deki şemaya bakın).
- Kesitleme sırasında en uygun sagital dilimleri elde etmek için platforma yerleştirildikten sonra beyinciğin düz durduğundan, ancak gerilmediğinden emin olun (Şekil 1Bb'deki şemaya bakın).
- Beyinciğin 300 μm kalınlığındaki sagital bölümlerini doku kıyıcı ile dilimleyin (Şekil 1Bb'deki şemaya bakınız). Bıçağın kuvveti ve hızı sahada optimize edilmelidir.
- Dilimlenmiş beyincik üzerine yavaşça bir damla diseksiyon ortamı ekleyin. 1 mL'lik bir pipet üzerine yerleştirilmiş geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, dilimlenmiş beyinciği yavaşça aspire edin ve buz gibi soğuk diseksiyon ortamı içeren 60 mm'lik hücre kültürü kabına geri aktarın (Şekil 1Bb''deki şemaya bakın).
- Mendil doğrayıcının plastik platformunu her beyincik dilimlemesi arasında %100 etanol ile temizleyin. Bir sonraki beyinciği platforma yerleştirmeden önce etanolün buharlaşmasına izin verin.
- Tek tek dilimleri ayırmak için iki ince düz forseps (veya alternatif olarak titanyum iğneler) kullanın ve vermisten 6-8 dilim seçin (Şekil 1Cc ve 1Cc'deki şemaya bakın).
- Kültür ekleri olan 6 oyuklu bir plaka alın ve 1 mL'lik bir pipete uyarlanmış geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, seçilen 4 adede kadar dilimi bir diseksiyon ortamıyla birlikte bir kültür ekine aktarın (Şekil 1Cc'deki şemaya bakın).
- Dilimleri, birbirleriyle temas halinde olmalarını önleyerek nazikçe doğru yere itmek ve çekmek için diseksiyon ortamını veya forsepsleri kullanarak kültür ekinin ortasına yerleştirin (Şekil 1Cc'deki şemaya bakın).
- İnce uçlu bir pipet ucu kullanarak dilimlerin etrafındaki fazla diseksiyon ortamını çıkarın. Dilimlerin zar üzerinde düz durduğundan emin olun (Şekil 1Cc'deki şemaya bakın).
- 6 oyuklu plakayı, dilimleri zar üzerine ekledikten hemen sonra inkübatöre yerleştirin.
