Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Dilim Kültürü Hazırlama
- Her iki cinsiyetten doğum sonrası 6 ila 7 günlük fareleri kullanarak fare organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlayın.
- Deiyonize suda 238 sükroz, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ve 11 glikozdan oluşan organotipik dilim kültürü için diseksiyon ortamı hazırlayın, daha sonra% 5 CO2/95%O2 ile 7.4 pH değerine kadar gaz.
- %78.8 (h/h) Minimum Esansiyel Orta Kartal, %20 (h/h) at serumu, 17.9 mM NaHCO3, 26.6 mM glikoz, 2 M CaCl2, 2 M MgS4, 30 mM HEPES, insülin (1 μg/mL) ve 0.06 mM askorbik asit, pH 7.3'e ayarlanmış organotipik dilim kültür ortamı hazırlayın. Bir ozmolametre kullanarak ozmolariteyi 310-330 ozmol'e ayarlayın.
- İki spatula kullanarak hipokampusu tüm beyinden ayırın ve bir doku kıyıcı kullanarak dilimleyin (400 μm). İki forseps kullanarak dilimleri ayırın ve eklerin altında kültür ortamı (950 μL) ile doldurulmuş 6 oyuklu bir plakada 30 mm'lik hücre kültürü eklerine aktarın.
- Organotipik dilim kültürlerini bir doku kültürü inkübatöründe (35 ° C,% 5 CO2) saklayın ve dilim kültürü ortamını iki günde bir değiştirin.
2. Plazmid Hazırlama
- İlgilenilen gen için plazmidi hazırlayın.
- Geliştirilmiş yeşil floresan protein (EGFP) genini bir pCAG vektörüne alt klonlayın.
- pCAG-EGFP plazmidini endotoksin içermeyen bir saflaştırma kiti ile saflaştırın ve 140 mM K-metansülfonat, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 ve 10 mM HEPES içeren dietil pirokarbonat ile muamele edilmiş sudan oluşan dahili bir çözelti içinde çözün, KOH ile pH 7.3'e ayarlandı (plazmit konsantrasyonu: 0.1 μg/μL).
3. Cam Pipet Hazırlama
- Borosilikat cam pipetleri (4,5–8 MΩ) bir mikropipet çekiciye çekin (Şekil 1A).
not: Tam hücreli yama kelepçesi kayıtları için kullanılan cam pipetler, elektroporasyon için idealdir.
- Sterilize etmek için cam pipetleri gece boyunca 200°C'de pişirin.
- Elektrik direncini yaklaşık olarak belirlemek için pipet ucunun boyutunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.
- İsteğe bağlı: Pipeti elektroporasyon elektroduna takarak pipet direncini doğrulayın ve pipet ucunu filtre ile sterilize edilmiş yapay beyin omurilik sıvısına (aCSF) sokmak için mikromanipülatörü kullanın (mM cinsinden): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ve deiyonize suda, %5 CO2/95%O2 ile gazlanmış 11 glikoz7.4 pH'a kadar. Elektroporatör üzerindeki okumayı kullanarak gerçek direnci onaylayın.
not: Pipet ucu ne kadar keskin olursa, elektrik direnci o kadar büyük olur. Pipet direnci 10 MΩ'un altında olmalıdır. Yüksek pipet direncine sahip cam pipetler (Şekil 1B), tekrarlanan elektroporasyon sırasında genellikle uçta tıkanır.
4. Elektroporasyon Teçhizatı Kurulumu
- Elektroporatörü, bir mikromanipülatör ve peristaltik pompa ile değişen bir masaya monte edilmiş dik bir mikroskopla donatılmış standart bir tam hücre elektrofizyoloji teçhizatına kurun.
- Elektroporatörün baş kısmını bir mikromanipülatöre takın ve elektroporatöre bir çift hoparlör bağlayın. Elektroporatörü, hazır olduğunda darbe göndermek için kullanılabilecek bir ayak pedalına bağlayın.
not: Hoparlörler açıldığında, elektrottaki elektrik direncinin bir göstergesi olan bir ton yayar. Bu, dikkati prosedürden uzaklaştırmadan dirençteki göreceli değişiklikleri belirlemeyi mümkün kılar.
5. Elektroporasyon Hazırlığı
- Dilim kültür eklerini 6 oyuklu plakalardan 900 μL kültür ortamı ile yüklenmiş 3 cm'lik Petri kaplarına aktarın ve elektroporasyon yapmaya hazır olana kadar bir masa üstü CO2 inkübatöründe saklayın.
- Elektroporasyondan sonra kültür dilimleri için taze kültür eklerini 3,5 cm'lik bir Petri kabında en az 30 dakika dilim kültür ortamı (1 mL) ile önceden inkübe edin.
- Teçhizatı temizleyin ve elektroporasyon için hazırlayın.
- Gün boyunca deneye başlamadan önce hortumu ve hazneyi sterilize etmek için hatları %10 ağartıcı ile 5 dakika boyunca perfüze edin.
- Tamamen durulamak için hatları en az 30 dakika deiyonize otoklavlanmış su ile perfüze edin.
- Hatları 0,001 mM tetrodotoksin (TTX) içeren filtre ile sterilize edilmiş aCSF ile perfüze edin.
not: TTX, internöronların aşırı uyarılmasına bağlı hücresel toksisiteyi ve ölümü en aza indirir.
- Elektroporatörün darbe parametrelerini ayarlayın: –5 V genlik, kare darbe, 500 ms tren, 50 Hz frekans ve 500 μs darbe genişliği.
- Cam pipeti 5 μL plazmid içeren iç solüsyonla doldurun.
- Pipet ucunda sıkışan hava kabarcıklarını, ucu birkaç kez hafifçe vurarak ve hafifçe vurarak çıkarın.
- Diseksiyon mikroskobu altında görselleştirerek veya pipet direncini kontrol etmek için adım 3.3.1'i tekrarlayarak uçta hasar olup olmadığını kontrol edin.
not: Uç hasar görmüşse, cam pipet atılmalı ve bu adım daha önce adım 3'te hazırlanmış olan yeni bir cam pipet ile tekrarlanmalıdır.
- Pipet ucunu elektroda güvenli bir şekilde takın ve hoparlörleri açın. Uç aCSF ortamıyla temas ettiğinde elektroporatörün okumasını (pipetin direnci) kaydedin.
- Keskin bir bıçak kullanarak kültür ekleme zarını kesin ve bir dilim kültürü izole edin. Dilim kültürünü keskin açılı forseps kullanarak elektroporasyon odasına dikkatlice aktarın ve konumunu bir dilim ankrajı ile sabitleyin.
- Nöronal sağlık veya fonksiyondaki değişiklikler gibi yan etkileri önlemek için dilim kültürünü bir seferde 30 dakikadan fazla inkübatörün dışında tutmayın.
6. İlgilenilen Hücreleri Elektroporate Edin
- Pipete ağızla veya hortuma bağlı 1 mL'lik bir şırınga (0,2-0,5 mL basınç) kullanarak pozitif basınç uygulayın.
- Pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yere hareket ettirmek için mikromanipülatörün 3 boyutlu düğme kontrollerini kullanın.
- Bir hedef hücre seçin ve hücre yüzeyinde mikroskopta görülebilen bir çukur oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak ona yaklaşın.
- Basınç döngüleri gerçekleştirin.
- Pipet ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşacak şekilde ağızdan hızlı bir şekilde hafif negatif basınç uygulayın, bu da zarın pipet ucuna bir şekilde yukarı çıkmasıyla görsel olarak gösterilir. Hoparlörlerden gelen ton artışını dinleyerek pipet direncinde bir artış (başlangıç direncinin ~ 2,5 katı) gözlemleyin. Çukurun yeniden oluşması için pozitif basıncı hızla yeniden uygulayın.
- Duraklamadan hemen en az iki basınç döngüsü daha tamamlayın, ardından negatif basıncı 1 s.
tutun
not: Döngüler arasında duraklamak, çok fazla basınç uygulamak veya negatif basıncı çok uzun süre tutmak, önemli hücre hasarına neden olabilir ve muhtemelen elektroporasyon sırasında hücrenin ölmesine neden olabilir.
- Hoparlörlerden gelen ton perdede sabit bir tepeye ulaştığında, en yüksek elektrik direncini gösteren ayak pedalını kullanarak elektroporatörü bir kez hızlı bir şekilde vurun. Nabzı göndermeden önce tepe direncinde 1 saniyeden fazla beklemeyin.
not: Bu protokolü kullanırken hedef dışı elektroporasyon gözlemlemedik. Sadece basınç döngüleri sırasında cam pipetle temas eden hücreler transfekte edildi. Pipeti diğer nöronların yakınına yerleştirmek gen transfeksiyonu ile sonuçlanmaz.
- Pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 μm uzağa nazikçe geri çekin.
- Direncin adım 5.5'te kaydedilen okumaya benzer olduğunu doğrulayarak pozitif basıncı yeniden uygulayın, ardından bir sonraki hücreye yaklaşın.
- Elektroporasyondan sonra görsel olarak veya önemli ölçüde artan (%>15 daha yüksek) pipet direnci ile gösterilen olası tıkanıklıkları pozitif basınç uygulayarak giderin.
not: Görünür bir tıkanıklık yoksa ve direnç hala önemli ölçüde yüksekse, pipeti atın ve yeni bir tane kullanın. Ortalama olarak, kullanıcı dikkatli davranırsa bir pipet 20'ye kadar elektroporasyon olayı için kullanılabilir.
Elektroporasyondan sonra, dilim kültürünü taze bir kültür ekine aktarın ve inkübatörde 35 ° C'de 3 güne kadar inkübe edin.
