$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Omuriliklerin Toplanması
>NOT: Sterilite için tüm aletler otoklavlanmalıdır (4 x 7 dakikalık döngüler için 135 °C ve 30 psi).
- 1-3 günlük C57BL / 6 fare yavrularını izofluran içeren bir odada ötenazi yapın. Hareketin kesilmesinden sonra 30 saniye bekleyin ve yanıt eksikliğini doğrulamak için bacağınızı sıkıştırın.
Yavru yüzüstü - pozisyonda olacak şekilde makas kullanarak başı vücuttan ayırın.
- Arka bacakları veya kuyruğu ve kolları, sırt tarafı kullanıcıya bakacak şekilde prosedür masasında sabitleyin.
- Kavisli iris makası kullanarak cildi kesin.
- Omuriliği bel bölgesinden kalçaların hemen üstünden kesin ve göğüs kafesinin her iki tarafını da vücuttan ayırmak için kesmeye devam edin.
not: Bu, diğer organlara yanlışlıkla zarar vermemek için omuriliğin iç organlardan dikkatli bir şekilde diseksiyonunu gerektirir (Şekil 1a).
- Fazla dokuyu çıkarmak için 5 mL 0,2 μm filtreyle sterilize edilmiş Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içeren 3 x 10 cm'lik Petri kaplarında 10 saniye boyunca sırayla yıkayın.
- Omurganın kaudal ucuna 22 mL filtreyle sterilize edilmiş PBS ile doldurulmuş bir 5G iğne ve şırınga yerleştirin ve kolun dördüncü bir Petri kabına çıkmasına izin vererek kraniyal olarak yıkayın (Şekil 1b).
- Omuriliği buz üzerinde 5 mL HABG (Tablo 1) ile 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Omuriliğin ezilmesini önlemek için dikkatli olun.
- Çöpteki her yavru için 1.1–1.8 adımlarını tekrarlayın.
not: İdeal olarak, sağlıklı nöron izolasyonunu sağlamak için bu işlem omurilik başına 30 dakikadan az sürmelidir.
2. Nöronları İzole Etme
NOT: Aşağıdaki adım, laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Temel steril tekniğe aşinalık beklenir.
- Doku Kıyma
- Omuriliği içeren tüpü alın ve dokuyu askıya almak için hafifçe sallayın.
- Tüpten 60 mm'lik bir cam Petri kabına doku dökün ve ~ 0,5 mm boyutunda ince parçalar oluşturmak için bir tıraş bıçağıyla doğrayın.
- Dokuyu geniş delikli bir pipet ile 5 mL HABG içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hücrelerin bu sıcaklıkta dengelenmesine izin vermek için 30 dakika boyunca 30 ° C'lik bir su banyosuna koyun. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarına izin verecek kadar bir çalkalayıcı üzerinde tutun.
not: Bu adım, buzdan sindirim ortamına transfer sırasında hücrelerin şoklanmasını önlemek için yapılır. Hücreleri 30 ° C'de tutmak, 37 ° C'de artan metabolizma ile ilişkili hücre ölümünü azaltmaya yardımcı olur.
- Sindirim ortamını hazırlayın (Tablo 1).
- Yoğunluk gradyanını hazırlayın (Tablo 1).
- 4 katmanın her birini Tablo 1'de belirtildiği gibi 4 ayrı 15 mL tüpte hazırlayın.
- Her katmandan 15 mL'lik yeni bir 15 mL'lik tüpe ekleyin. En alttaki katman 1 ile başlayın ve en üstteki katman 4'e ulaşana kadar sırayla ekleyin. Eklerken katmanları rahatsız etmekten kaçının.
- PDL kaplı plakaları yıkayın. Kalan suyu çıkarmadan ve 1 saat kurumaya bırakmadan önce birkaç dakika steril suyla yıkayın.
- Dokuyu sindirim ortamına aktarın.
- Doku içeren tüpü 30 °C'de çalkalayıcı su banyosundan çıkarın ve birkaç dakika dinlenmesine izin verin.
- Çürütme ortamı tüpünü 37 ° C'lik su banyosundan çıkarın ve leur kilitli bir şırıngaya aspire edin.
- Doku içeren tüpten fazla HAGB'yi aspire edin.
- Doku içeren tüpe sindirim ortamı eklemek için şırınga üzerinde 0,2 μm'lik bir leur-lock filtre kullanın.
- Tüpü 30 dakika boyunca 30 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarına izin verecek kadar sallanmaya devam edin.
not: Hücreleri sindirim ortamında çok uzun süre tutmamak veya sıcaklığın çok yükselmesine izin vermemek önemlidir, bu da aşırı sindirime yol açabilir ve dokunun jelatinimsi bir karışım içinde asılı kalmasına neden olabilir.
- Bu süre zarfında laminini kaplayın.
- Tritürasyon yapın (yani hücreleri dokudan ayırmak).
- Tüpü çalkalanan 30 °C su banyosundan çıkarın ve birkaç dakika dinlenmesine izin verin.
- Aşırı sindirim ortamını aspire edin.
- Dokuyu 2 mL HABG'de askıya alın.
- Dar delikli bir pipet kullanarak 45 s.
için 10x ezme işlemi yapın
not: Bu muhtemelen en önemli adımdır ve düzgün yapılmadığı takdirde verimi önemli ölçüde azaltabilir.
- Dokuyu pipete aspire edin ve içindekileri hemen geri boşaltın.
- Canlı verimi önemli ölçüde azaltacağı için hava vermekten kaçının.
not: İdeal pipet 9" cam pipettir. Pürüzlü yüzeyleri düzeltmek için pipetin ucu ateşle parlatılmalıdır. Daha sonra kloroformda 1:20'lik bir diklorodimetilsilan (DMDCS) çözeltisine yerleştirilerek silikonlanmalı ve O/N bırakılmalıdır. Pipet daha sonra çıkarılmalı ve kurumaya bırakılmalıdır. Daha sonra sterilizasyon için otoklavlanmalıdır.
Dikkat: DMDCS ve kloroform son derece yanıcıdır ve silikonlama bir davlumbazda yapılmalıdır.
- En üstteki 2 mL süpernatanı aspire edin ve "koleksiyon" etiketli 15 mL'lik yeni bir tüpe yerleştirin.
- 2.7.3–2.7.5 adımlarını iki kez daha tekrarlayın (hücre toplama tüpünün sonunda 6 mL olmalıdır).
- Toplama tüpü içeriğini, degradenin bozulmasını önleyerek adım 2.2'de hazırlanan gradyan tüpüne yavaşça aktarın.
- Bu noktada, önceden hazırlanmış nörobazal ortamı (Tablo 1) buzdolabından çıkarın ve 37 ° C'lik bir banyoda ısınmasına izin verin.
- Nöronları arındırın.
- Gradyan tüpünü 800 x g ve 22 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- İstenilen katmanları bir pipetle toplayın (Şekil 2) ve 15 mL'lik yeni bir tüpe yerleştirin. En yüksek saflıkta nöron izolasyonu için (yani %>90), katman 3'ü toplayın. Daha az saflıkta (yani %>70-80) daha fazla verim için, 2. ve 3. katmanları toplayın.
- Yeni toplanan katmanlara 5 mL HABG ekleyerek yoğunluk gradyanını seyreltin.
- 22 ° C'de 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, 5 mL HABG'de yeniden süspanse edin ve hücreleri askıya almak için peleti hafifçe vurun.
- 22 ° C'de 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, 3 mL nörobazal ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için peleti hafifçe vurun.
< td colspan="2">25 mg)
| medya | depolama | Malzemeler | hazırlık |
| HABG | 4 °C / 24h | | >100 mL | - B27'yi 4 °C buzdolabında çözdürün O/N
- Filtre sterilizasyonu (0,22 μm) |
| Hazırda Bekletme A | 97.8 mL |
| B27 [%2] | 2 mL |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL |
| Nörobazal Medya | 4 °C/1 hafta | | >100 mL | - B27'yi 4 °C buzdolabında çözdürün O/N
- Filtre sterilizasyonu (0,22 μm)
- 50 mL'lik porsiyonları 50 mL'lik tüplere ayırın (4 °C'de saklayın) |
| Nörobazal A | 97 mL |
| B27 [%2] | 2 mL |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL |
| Kalem/Strep [%1] | 1 mL |
| Sindirim Ortamı | İzolasyon Günü | | >10 mL | - Kuvvetlice sallayın
- 37°C banyoda 30 dakika bekletin (ideal olarak kullanımdan 30 dakika önce hazırlanır)
- Filtre sterilizasyonu (0,22 μm) |
| HA-Ca (İngilizce) | 10 mL |
| Papaz Otu |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.025 mL |
| Yoğunluk Gradyanı | İzolasyon Günü | | 1 Gradyan | |
| Katman | OptiPrep (Optik Hazırlık | HABG (Türkçe) |
| (0,13 mL) | (5,29 mL) |
| 1 Alt | 0.26 mL | 1,24 mL |
| 2 | 0.19 mL | 1.31 mL |
| 3 | 0.15 mL | 1.35 mL |
| 4 Üst | 0.11 mL | 1.39 mL |
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan ortam ve solüsyonların hazırlanması.
