Kardiyopulmoner Kompleks Decellularizasyon: Murin Modelinden Kalp ve Akciğerleri Hücreden Arındırma Tekniği

Abstract

Kaynak: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Murin Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücresinin Kaldırılması. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, deterjanların damar sistemi boyunca antegrad perfüzyonu uygulanarak hücreden arındırılmış hücre dışı matris veya ECM iskeleleri üretme yöntemi gösterilmektedir. Yapısal ECM iskeleleri daha sonra kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM yeniden modellemesini analiz etmek için kullanılabilir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Ölüm Sonrası Mikrocerrahi

1. Bir CO₂ odası kullanarak fareyi ötenazi yapın.
   1. Fareyi 4 L'lik bir hazneye yerleştirin ve 2 dakika boyunca 0,2 L / dk'dan başlayarak% 100 CO 2 ile doldurmaya başlayın, 3 dakika sonra 0,8 L / dk'lık bir akışa ulaşana kadar artırın. Fare ilk 2 dakika boyunca bilinçsiz düşmeli ve ardından solunum durmalıdır (genellikle yaklaşık 5 dakika, ancak akış gerektiği gibi korunabilir). Bir sonraki adıma geçmeden önce ölümü onaylayın.
2. Farenin göğsünü, karnını ve sırtını saç kesme makinesi ile tıraş edin ve %70 etanol ile dezenfekte edin. Tıraş, görüntüleme veya biyokimyasal analiz için numunelerde saç bulunması nedeniyle artefakt sayısını büyük ölçüde azaltır.
3. Fareyi, ön ve arka ayaklarının yanı sıra başını ve kuyruğunu uzatarak polistiren bir tepsiye sabitleyin. Mikrocerrahi mikroskobunun altına yerleştirin.
4. Bir Mayo düz desen makası kullanarak, submandibular bölgeden alt karın bölgesine uzanan kutanöz bir kesi ile cerrahi erişim sağlayın ve torasik duvarı ve peritonu ortaya çıkarmak için deri altından diseksiyon yapın.
5. Mikrocerrahi makas kullanarak, göğüs duvarının her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis minör kaslarını kesin.
6. Düz desenli makas kullanarak, sternumu önceki kesiler boyunca kesin ve ardından sternumu uzun ekseni boyunca keserek bir sternotomi tamamlayın, ardından kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını kaldırın ve sabitleyin.
7. Yuvarlak uçlu mikro forseps (veya Dumont mikro forseps) kullanarak, timus ve çevresindeki yağ dokusunu ataşmanlarından nazikçe çekerek çıkarın. Bu, büyük gemileri ortaya çıkaracaktır.
8. Koteriyi kullanarak inen kava damarını koterize edin ve düz desenli makas kullanarak yemek borusunu kesin.
9. Keskin mikro forsepsler kullanarak, ligasyonu ve koterizasyonu kolaylaştırmak için brakiyosefalik venleri ve brakiyosefalik, sol ortak karotis ve sol subklavyen arterleri alttaki dokudan ayırın.
10. Mikro iğne tutucu, keskin mikro forseps ve 9-0 sütür kullanarak dikişleri brakiyosefalik, sol ana karotis ve sol subklavyen arterlerin çıkışının üzerine yerleştirir.
11. Brakiyosefalik damarları koterize edin.
12. Boyun kaslarını ve trakeayı ortaya çıkarmak için submandibuler tükürük bezlerini orta hat boyunca ayırın. Krikotiroid ligamentini ortaya çıkarmak için kasları ayırın. Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere ayırarak bir giriş açın.
13. Trakeaya 27 G'lik bir kateter yerleştirin ve trakea bronşlara dallanana kadar nazikçe itin (yani, katetere direnç karşılanana kadar, ardından 3 mm geri çekilin). Bronşları bozmamaya dikkat edin. 6-0 dikiş kullanarak, kateteri sabitlemek için trakeanın etrafına 3 dikiş yerleştirin.
14. Fareyi 12. torasik omurun yüksekliğinde bölümlere ayırın. İnen aort omurganın önüne doğru uzanır ve burada omurga ile birlikte bölümlere ayrılmalıdır. Alt yarısını ayırın.
15. Aortu retrograd olarak kateterize edin ve kateteri aort yayına ulaşana kadar itin. 9-0 sütür kullanarak, kateter ucunun 5 mm altından başlayarak aort etrafına 4 dikiş yerleştirin.

2. Hücresellikten Arındırma

1. Silikon boru ve Luer konektörleri kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca 200 μL / dk'da deiyonize su ile perfüz. Hücreden arındırma sırasında bu akış hızını koruyun.
2. Perfüzyon ajanını, deiyonize suda seyreltilmiş %0.5 sodyum deoksikolat (DOC) ile değiştirin ve gece boyunca perfüze edin.
3. Perfüzyon ajanını, deiyonize su ve 8 saat perfüzde seyreltilmiş %0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) olarak değiştirin.
4. SDS ve DOC'u 24 saat boyunca yıkamak için gece boyunca deiyonize su ile perfüz.
5. Hücreden arındırılmış kalp ve akciğerleri, kavisli bir makas kullanarak eklerini göğüs kafesine bölerek rezeke edin ve 4 °C'de %1 (h/h) penisilin-streptomisin ve 0.3 μM sodyum azid içeren deiyonize su içeren steril bir kriyo-tüpte saklayın. ECM iskeleleri en az 12 hafta saklanabilir. İskele biyokimyasal analiz (örneğin kütle spektrometresi) için kullanılacaksa, sıvı nitrojeni dondurun.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mikrocerrahi
6-0 sütür, üçgen kesitli iğne (Vicryl)	Etik	6301124
9-0 mikro sütür (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forseps	Güzel Bilim Araçları	11006-12
Dişli Adson forseps	Güzel Bilim Araçları	11027-12
Castroviejo mikro iğne tutucu	Güzel Bilim Araçları	12061-01
Fare ötenazisi için CO2 havalandırma odası
Deiyonize su (Milli-Q IQ 7000, Ultra saf laboratuvar suyu sistemi)	Merck	ZIQ7000T0
Tek kullanımlık polistiren tepsi (~30 × 50 cm)
Diseksiyon mikroskobu (Greenough, iki kollu deveboynu ile)	Leica Belediyesi	S6 D
Çift uçlu mikrospatula	Güzel Bilim Araçları	10091-12
Dumont mikroforsepsleri (iki)	Güzel Bilim Araçları	11252-20
45° uçlu Dumont mikroforseps	Güzel Bilim Araçları	11251-35
Saç kesme makineleri	Oster	76998-320-051
Halsey iğne tutucu (tungsten karbür çeneli)	Güzel Bilim Araçları	12500-12
İntravenöz 24 gauge kateter (Insyte)	Bd	381512
İntravenöz 26 gauge kateter (Terumo)	Sörf Salonu-W	SR+DM2619WX
Mayonez makas (sert kesim, düz)	Güzel Bilim Araçları	14110-15
Halkalı uçlu mikroforseps	Aesculap Belediyesi	FM571R
Mikro yaylı makas (Vannas, kavisli)	Güzel Bilim Araçları	15001-08
İğneler (27 gauge; Mikro mızrak)	Bd	21018
Kağıt havlu (steril) veya cerrahi peçete
Tırtıklı makas (CeramaCut, düz)	Güzel Bilim Araçları	14958-09
Spatula (Freer-Yaşargil)	Aesculap Belediyesi	OL166R
Şırıngalar (1 mL; Plastipak)	Bd	3021001
Şırıngalar (10 mL; Plastipak)	Bd	3021110
Tendon makası (Walton)	Güzel Bilim Araçları	14077-09
HÜCRE DIŞI BIRAKMA
% 70 Etanol (mutlak alkol% 99.9); mutlak alkol, deiyonize su kullanılarak% 70'e (hacim / hacim) ayarlanmalıdır	erik	1680766
Deiyonize su (Milli-Q IQ 7000, Ultra saf laboratuvar suyu sistemi)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tube erkek bağlantı parçaları (1/8 inç)	Dünya Hassas Aletler	13158-100
Luer-to-tube erkek bağlantı parçaları (1/8 inç)	Dünya Hassas Aletler	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Bilimsel	70011044
Penisilin-streptomisin	Gibco (Gibco)	15140122
Peristaltik pompa (12 kanallı)	Ole Dich	110AC (R) 20G75
Silikon boru (2 mm iç çap ve 4 mm dış çap ile)	Ole Dich	31399
Sodyum Azid	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodyum deoksikolat (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G