Fare Modelinden Circumvallate Papilla (CVP) Epitelinin İzolasyonu: CVP Epitelini Fare Dilinden Ayırmak İçin Enzimatik Bir İşlem

Özet

Kaynak: Shechtman, L. A. et al. Yetişkin Fare Tat Kök Hücrelerinden Türetilen Lingual Organoidlerin Üretimi ve Kültürü. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, bir murin dilinden circumvallate papilla (CVP) epitelinin izolasyonunu açıklıyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. CVP Epitelinin İzolasyonu

1. Fareleri IACUC düzenlemelerine göre CO₂ boğulması ile ötenazi yapın, ardından bilateral torakotomi, servikal çıkık, dekapitasyon veya kan kaybı gibi onaylanmış bir ikincil yöntem uygulayın.
2. Yanakları kesmek ve çeneyi kırmak için büyük steril diseksiyon makası kullanın. Dili kaldırın ve dili ağız boşluğunun tabanından ayırmak için lingual frenulumu kesin. Dili kesin ve steril, buz gibi Dulbecco'nun Ca²⁺ ve Mg^{2+ ile fosfat tamponlu tuzlu salininde (dPBS) toplayın}.
3. Bir jiletle intermolar çıkıntının hemen ön tarafını keserek ön dili çıkarın ve atın (Şekil 1A, kesikli çizgi). Arka dildeki tüyleri ve fazla sıvıyı temizlemek için hassas bir görev mendili kullanın.
4. 1 mL şırıngayı 200-300 μL enjeksiyon enzim çözeltisi ile doldurun (son konsantrasyon: Ca^2+/Mg2+ içeren dPBS, 10 mg/mL stok solüsyonlarından seyreltilmiş) ve intermolar çıkıntının hemen üzerine 30 G x 1/2 iğne yerleştirin (Şekil 1B, siyah ok) CVP'nin hemen önüne kadar (Şekil 1B, kara kutu). Enzim solüsyonunu CVP'nin altına ve yan kenarlarına, epitel ve alttaki dokular (lamina propria, kas) arasına enjekte edin. Enjeksiyon yapılırken şırıngayı dilden yavaşça ve sürekli olarak çekin.
5. Dili steril Ca²⁺/Mg²⁺-içermeyen dPBS'yi oda sıcaklığında tam olarak 33 dakika inkübe edin.
6. Ekstra ince diseksiyon makası kullanarak epitelde bilateral ve CVP'nin hemen önünde küçük kesikler yapın ve epiteli ince forseps ile kaldırarak nazikçe soyun. Siper epiteli alttaki bağ dokusundan kurtulduktan sonra, FBS ile önceden kaplanmış boş bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. CVP epitelini ayırmadan önce veya sonra epitel kesimini yapın (Şekil 1C, D).

Sonuçlar

Şekil 1: Diseke dil ve soyulmuş CVP epiteli. (A) Dil diseke edilir ve ön dil, intermolar eminensin hemen önü kesilerek (kesikli çizgi) çıkarılır, CVP'yi (kara kutu) içeren arka dil bırakılır (B) İntermolar eminensin (siyah ok) hemen önüne bir iğne sokulur ve enzim karışımı CVP'nin (kara kutu) altına ve yan kenarlarına enjekte edilir. (C

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL TB Şırınga	BD Şırınga	309659
Dulbecco'nun Ca²⁺ ve Mg²⁺ İçeren Fosfat Tamponlu Salin	Gibco (Gibco)	10010-023
Dulbecco'nun Ca²⁺ ve Mg²⁺ İçeren Fosfat Tamponlu Salin	Sigma Yaşam Bilimleri	D8662-500ML
Dumont #5 Forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-30
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gibco (Gibco)	26140-079
1 mL TB Şırınga	BD Şırınga	309659
2.0 mL Mikrosantrifüj Tüpleri	ABD Bilimsel	1420-2700
Cerrahi Makas - Sharp	Güzel Bilim Araçları	14002-14
Ekstra İnce Bonn Makası	Güzel Bilim Araçları	14084-08
Büyük Rakamlı Zamanlayıcı/Kronometre	Balıkçı Bilimsel	S407992
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi SV6
Cohan-Vannas Yaylı Makas	Güzel Bilim Araçları	15000-02
Clostridium histolyticum'dan kollajenaz, tip I	Sigma Yaşam Bilimleri	C0130-1G
Dispas II (nötr proteaz, derece II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001

Serisi arası