$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikro Kabarcık Hazırlama
- Mikro kabarcıkların enjeksiyon için hazırlanması
not: Asistan bu adımı, 'Embriyolara Mikro Kabarcıkların (MB) Enjeksiyonu' başlatıldığında gerçekleştirir. Her embriyo bir kez enjekte edilir, her enjeksiyon için seçilen mikro kabarcık tipi asistan tarafından rastgele seçilir, böylece tüm mikro kabarcık türleri prosedür boyunca eşit olarak dağıtılır, ancak rastgele bir sırayla verilir. Cerrahın enjekte edilen baloncuk türüne karşı kör olduğundan emin olun.
- 400 μL'lik bir hacimde 1 x 108 MB/mL'lik bir nihai konsantrasyon üretmek için gereken stok kabarcık çözeltisinin hacmini belirleyin (stok konsantrasyonlarını kullanarak hacmi hesaplayın). Karşılık gelen salin hacmini boş bir mikrosantrifüj tüpüne alın.
- Seçilen mikro kabarcık şişesini nazikçe çalkalayın ve 21 G iğneyi kullanarak çözeltinin fazla hacmini (yukarıda hesaplanandan ~ 50 μL daha büyük) 1 mL'lik bir şırıngaya çekin. Mikro kabarcıkları boş bir mikrosantrifüj tüpüne enjekte edin.
- Gerekli hacimde mikro kabarcık stok çözeltisini pipetleyin ve tuzlu su çözeltisine ekleyin. Pipetin ucuyla hafifçe karıştırarak karıştırın.
- Seyreltilmiş mikro kabarcık çözeltisini 21 G iğneyi kullanarak temiz bir şırıngaya çekin. İğneyi çıkarın, şırıngadaki hava kabarcıklarını ortadan kaldırın ve luer ve boruyu takın. Herhangi bir hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek çözeltiyi yavaşça borunun ucuna itin.
- Şırıngayı, mikro kabarcıkları toplam 20 μL'lik bir hacim için 20 μL/dk hızında dağıtmak için ayarlanmış bir şırınga infüzyon pompasına yerleştirin. Borunun ucuna çekilmiş bir cam iğne takın. Pompayı enjeksiyon aşamasına yaklaştırın.
2. Embriyolara Mikro Kabarcıkların Enjeksiyonu
- Soğutulmuş ortam kabından rastgele bir embriyo seçin ve çıkarın (delikli kaşıkla). Stereoskopun altındaki ultrason sahnesinde bulunan diseksiyon kabına yerleştirin ve yumurta sarısı kesesini ve amniyotik zarları ince forsepslerle çıkarın, en az vaskülarize görünen taraftan (antiyomiyal taraf) kesin/yırtın. Bu, en kolay şekilde baş bölgesine bitişik bir alanın delinmesiyle elde edilir.
- Embriyoyu içeriden çıkaracak kadar kesin, ama daha fazla değil. Diseksiyon tabaklarını küçük hamuru parçaları kullanarak stabilize edin.
- Kesesi embriyonun etrafından nazikçe hareket ettirin. Embriyoyu plasenta ve göbek damarları önde olacak şekilde yan yatırın. Böcek pimlerini kullanarak, yerine sabitlemek için yumurta sarısı kesesini (4 pim önerilir) ve plasentanın kenarlarını gerektiği gibi sabitleyin. Büyük gemilerden kaçının.
- Embriyo canlanana kadar embriyoyu önceden ısıtılmış 45 ° C PBS ile yıkayın. Göbek damarını ve ilişkili vasküler ağını tanımlayın. Çanağı, enjeksiyonun rahatça yapılabileceği şekilde konumlandırın.
not: Isındıktan sonra, embriyodaki kan akmaya başlar ve umbilikal arterde gözle görülür şekilde pompalanır. Akış ilk başladığında, damarlar parlak kırmızı renkte olur ve her iki damardaki kan hızla aynı görünür. Göbek damarından çıkan dallar genellikle plasenta yüzeyindeki göbek atardamarından gelen dalları kaplar.
- Embriyo canlandıktan sonra, önceden ısıtılmış US jeli ile örtün (ancak plasentayı değil), embriyonun etrafındaki hava kabarcıklarını (ince forsepsleri kullanarak) hassas bir şekilde çıkardığınızdan emin olun. Çanağı önceden ısıtılmış PBS ile doldurun.
not: PBS ve jel şırıngalardaki çözelti seviyesine dikkat edin ve gerektiğinde ısıtma kabına yedek şırıngalar ekleyin.
- Cam iğneyi diseksiyon kabının kenarındaki büyük bir hamuru topuna monte edin ve iğne ucunu PBS'ye yerleştirin. Plasental diskin koryonik yüzeyinde, ana daldan makul olduğu kadar uzakta bir damar seçerek, ucu makas kullanarak boyuta göre kesin. Uç hafif bir açıyla kesilirse enjeksiyon en kolay yoldur. Yaylı makasın kenarını kullanarak camın pürüzlü kenarlarını çıkarın.
- Şırınga pompasını kullanarak, mikro kabarcık çözeltisini 20 μL/dk'da cam iğneye yavaşça enjekte edin, ta ki iğne ucundaki tüm hava dışarı atılana ve mikro kabarcıkların PBS'ye serbestçe aktığı görülene kadar. Pompayı durdurun ve 20 μL'lik bir enjeksiyon hacmi için sıfırlayın. Enjeksiyon sırasında embriyonun damar sistemine hava girmesine izin vermeyin.
- Cam iğne ucunu plasentadaki damarlardan birine nazikçe sokun ve hareketsiz olduğundan emin olun. Stereoskop kafasını sallayın ve dönüştürücüyü embriyonun üzerine yerleştirin. Görüntülemeyi başlatın.