Sürüntü Bazlı Konjonktival Kommensal Bakteri İzolasyonu: Murin Modelinin Konjonktivasından Kommensal Bakterileri İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Smith-Page, K. et al. Farelerde Konjonktival Kommensal İzolasyon ve Tanımlama. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, canlı kommensal bakterileri oküler konjonktivadan izole etmek için sürüntü tabanlı bir teknik açıklanmaktadır. Teknik, patojenlere karşı savunma rolü oynayan konjonktivanın kommensal bakteriyel mikrobiyomunun profilini çıkarmak için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Göz Çubuğu Hazırlama, Çalışma Alanı Kurulumu, Fare Gözü Temizleme ve Numune Zenginleştirme

1. Steril Göz Temizleme Çubukları Hazırlayın
   not: Steril göz çubukları, ince elyaf ince bir pamuk tabakası ile ince kaplanmış ahşap kürdanlardır ve evde yapılır.
   1. Sürüntü alınacak fare sayısı için uygun miktarda pamuklu çubuk ve kürdan otoklavlayın.
   2. Başparmağınız ve işaret parmağınızla yarım santimetre uzunluğunda bir pamuk parçasını sıkıştırın. Düz tek gözenekli bir tabaka oluşturmak için başparmaklar ve işaret parmaklarıyla kenarları çekerek vuruşu gevşetin, vuruş dağılmadan hemen önce durun (gerilmiş vuruş boyunca dağılmış küçük pamuk parçaları kabul edilebilir).
   3. Gerilmiş parçayı bükülürken kürdan ucuna hafifçe tutarak kürdanın keskin uçlarından birinin etrafında döndürün, Şekil 1'e bakın. "Tamamlanmış" göz çubuğu, uçtan yaklaşık bir buçuk ila bir santimetre uzağa uzanan, ucun üzerine gerilmiş çok ince bir pamuk tabakasına sahip olacaktır.
   4. "Tamamlanmış" çubukları küçük behere yerleştirin, çubukla bakacak şekilde aşağı bakın ve kapatın. Otoklav.
2. Çalışma alanını ayarlama
   1. Steril 50 mL steril santrifüj tüpünde 2 mL ketamin (100 mg / mL), 400 μL ksilazin (100 mg / mL) ve 27.6 mL steril salin (dH₂O'da %0.9 NaCl) içeren anestezi hazırlayın. Filtre, hemen kullanım için anesteziyi sterilize eder ve alikot yapın (1 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir; kullanmadan önce daima oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin).
   2. Kontaminasyonu en aza indirmek için çalışma alanını dezenfektanla temizleyin ve temizleyin.
   3. 0.5 mL steril Beyin Kalp İnfüzyon ortamını (BHI) etiketli 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerine (fare ve kontrol başına 1 tüp) alikot; mikrosantrifüj rafına yerleştirin. Rafı buzun üzerine yerleştirin.
   4. İş akışını aşağıdaki gibi ayarlayın (soldan sağa): fare anestezi istasyonu (deney fareleri içeren kafes, boş steril kafes, oda sıcaklığında anestezi, 25 G iğne ve 1 mL şırınga), göz sürüntü istasyonu (buz üzerinde BHI, sterilize göz çubukları, temiz kağıt havlular, %70 izopropanol sprey) ve kaplama istasyonu (oda sıcaklığında kan agar plakaları, 10 μL pipet, 10 μL steril tek kullanımlık uçlar, biyolojik tehlike atık kabı).
3. Göz Temizleme
   1. Her yetişkin fareye intraperitoneal olarak sırasıyla 1 g fare ağırlığı dozu ketamin ve ksilazin için 10 μL anestezi uygulayın ve otoklavlanmış bir kafese yerleştirin. Arka ayak pedini sıkarak anesteziyi test edin; Hiçbir hareket uygun anesteziyi göstermez.
   2. Bir elinizi sadece anestezi uygulanmış fareleri tutmak için, diğer elinizi ise sadece göz çubuğunu ve kültürü tutmak için atayın. Temizleme için, tamamen anestezi uygulanmış fareyi kafesten çıkarın; Sol gözünüz açıkta kalacak şekilde yan yatırılmış temiz çalışma yüzeyinin üzerine yerleştirin. Eldivenli ellerinize izopropanol püskürtün, temiz kağıt havluyla kurulayın.
   3. Özel olarak etiketlenmiş BHI mikro santrifüj tüpünün kapağını özel medya taşıma eli ile açın. Tüpü buz üzerindeki mikro santrifüj rafına geri yerleştirin. Göz çubuğunun pamuk kaplı ucunu BHI'ye batırın, fazla sıvıyı çıkarmak için ucu iç tüpe karşı 2 kez döndürerek göz çubuğunu tüpten çekin.
   4. Fareyi tutan eliyle, fareyi boynundan nazikçe tutun. Öte yandan, göz sürüntüsünün ucunu sol gözün medial konjonktival bölgesine yerleştirin, bkz. Şekil 2A. Göz küresine hafifçe bastırın ve swabı alt göz kapağı ile göz arasında 10 kez ileri geri (Şekil 2B) bir pencere yıkama hareketiyle hareket ettirin. Sabit basıncı koruyun.
   5. Kürke dokunmadan, swabın ucunu yerleştirildiği yere dik olacak şekilde nazikçe çıkarın ve swabı pamuklu tarafı aşağı bakacak şekilde doğrudan BHI ortamı içeren etiketli bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Sürüntü alınan göze kayganlaştırıcı bir göz damlası uygulayın.
   6. Fareyi kafese geri koyun.
   7. Swabı buz üzerinde 10 ila 15 dakika bekletin ve sterilize edilmiş eldivenli el ile ucu ortamda 10 tur karıştırarak göz swabını çıkarın. 5 dönüş için ucu mikro santrifüj tüpünün iç duvarına doğru döndürerek swabı geri çekin. Swabı biyolojik tehlike kabına atın.
   8. Her fare ve kontrol örnekleri (deri veya kürk çubuğu) için 1.3.2 ila 1.3.7 arasındaki adımları tekrarlayın. Eldivenleri her çubuk arasında uygun şekilde sterilize edin.
4. zenginleşme
   1. Tüpü 37 °C'de 1 saat statik olarak inkübe ederek numuneyi zenginleştirin
   2. Kuluçka sırasında, bir oda sıcaklığında Triptikaz Soya'yı fare başına %5 koyun kanı agar plakası (TSA plakası) ile etiketleyin ve ikiye bölün.
   3. Göz sürüntü kültürü inkübasyonundan sonra, zenginleştirilmiş örnekleri inkübatörden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin.
   4. Numuneleri kısaca vorteksleyerek karıştırın ve Şekil 3A'daki şemaya göre plakalayın. Numunenin 10 μL'sini TSA plakasına alın ve plakayı bir şerit oluşturacak şekilde eğin, 2 kez tekrarlayın.
   5. Plakanın bölme çizgisinin diğer tarafında, agar üzerine 10 μL numune noktalayın, 9 kez tekrarlayın.
   6. Plakaları 37 °C'de 18 saat, 2 gün ve 4 gün inkübe edin (agar plakalarının kurumasını önleyen temiz bir odada). Kolonileri şeritler halinde sayın, morfolojiyi not edin ve morfolojik olarak benzer izolatlar için sürüntü başına koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) hesaplayın. Şeritler halinde yakalanmayan benzersiz organizmalar için noktalara bakın.

Sonuçlar

Şekil 1: Ev içi göz sürüntüsü.
(A) Steril kürdan ucu ile işaret parmağı arasına ince, yaklaşık 1 cm'lik ince bir parça çekilmiş pamuk keçesi tutuldu ve kürdan, pamuk kürdan ucuna tamamen yuvarlanana kadar işaret parmağına hafif bir baskı uygulanarak yuvarlandı. (B) Göz sürüntüsü örneği.

<...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,1 ila 10 μL pipet ucu	ABD Bilimsel	1110-300	Kullanmadan önce otoklav
0,5 ila 10 μl Eppendorf pipeti	Balıkçı Bilimsel	13-690-026
1 ml şırınga	Balıkçı Bilimsel	BD309623	Her göz sürüntüsü grubu için 1 şırınga
1.5 ml Eppendorf tüpleri	ABD Bilimsel	1615-5500	Kullanmadan önce otoklav
1000 μ ml pipet ucu	ABD Bilimsel	1111-2021	Kullanmadan önce otoklav
200 ila 1000 μl Gilson pipet makinesi (P1000)	Balıkçı Bilimsel	F123602G
25 G iğne	Balıkçı Bilimsel	14-826AA	Her göz sürüntü grubu için 1 iğne
% 3 Hidrojen Peroksit	Balıkçı Bilimsel	S25359 Serisi
37 ° C Kuluçka Makinesi	Laboratuvar ekipmanları
% 70 İzopropanol	Balıkçı Bilimsel	PX1840-4
Ana-Sed Enjeksiyonu (Ksilazin 100 mg / ml)	Santa Cruz Hayvan Sağlığı	SC-362949Rx
Bunsen Brülör	Laboratuvar ekipmanları
Temiz kağıt havlular	Laboratuvar ekipmanları
Pamuk Vuruş / Steril haddelenmiş pamuk	Özgeçmiş
Ketamin (100 mg/ml)	Henry Schein	9950001
Fare	Jackson Laboratuvarları	C57/BL6J
Petri Kapları	Balıkçı Bilimsel	08-757-12	Mannitol Tuz agar plakaları için
RPI Beyin Kalp İnfüzyon Ortamı	Balıkçı Bilimsel	50-488525	Talimatlara ve otoklava göre hazırlayın
SteriFlip (0,22 μm gözenek boyutu polyester sülfon)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	Anesteziyi sterilize etmek için
Steril fare kafesi	Laboratuvar ekipmanları
Kürdan (yuvarlak bambu)	Mutfak Temelleri		Kullanmadan önce otoklav ve sürüntü hazırlama
%5 Koyun Kanı Plakalı Triptikaz Soya Agar II	Balıkçı Bilimsel	4321261	Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın
Tek kullanımlık göz damlası	CVS Eczane		Bausch ve Lomb Soothe Kayganlaştırıcı Göz Damlası, 28 şişe, 0.02 fl oz. her biri

arası Serisi