Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Solüsyon ve Perfüzyon Aparatı Hazırlama
- Sabit akışlı bir Langendorff aparatı monte edin (ticari olarak temin edilebilir veya kendi kendine yapılır). Şekil 1'de basit bir şema verilmiştir.
- Çözeltileri Tablo 1 ve Tablo 2'de verilen reaktiflere göre hazırlayın.
- Sirkülasyon suyu banyosunu açın ve perfüzat sirkülasyon sisteminin kanülden dışarı akışının 37 °C'ye ulaşmasını sağlamak için uygun bir giriş sıcaklığını (laboratuvarımızda 42,7 °C) ayarlayın.
- Deiyonize su dolaştırarak perfüzyon sistemini temizleyin. Steril bir durum gerekiyorsa, perfüzyon sisteminden 15 dakika boyunca% 75 etanol çalıştırın, ardından deiyonize su (kalp üzerindeki alkol toksisitesi etkilerini önlemek için en az 10 döngü).
- Bir sonraki perfüzyon adımında kaç mililitre oksijenli Tyrode çözeltisinin yükleneceğini belirlemek için perfüzat sirkülasyon sisteminin bir döngüsünün süresini ve hacmini ölçün.
- Tüm cerrahi aletleri istenilen yöntemle sterilize edin.
- Perfüzat perfüzyon sisteminin akış hızını 4 mL/dk olarak ayarlayın.
- Biri Tyrode solüsyonu (Petri kabı 1), diğeri solüsyon 1 (Petri kabı 2) içeren iki temiz 35 mm Petri kabı hazırlayın.
- Çözelti 1 ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga ve uca olan mesafenin 1 mm olduğu yerden bir çentikli 20 G künt çelik kanül iğnesi hazırlayın. Kanül miline 3-0 dikişle gevşek bir düğüm hazırlayın. Stereomikroskobun görüş alanını düzenleyin ve kanül ucunun Petri kabı 2'nin sıvı yüzeyinin altında olduğundan emin olun.
2. Hayvan Hazırlama
- Kan pıhtılarını önlemek için farelere intraperitoneal olarak heparin (konsantrasyon, 1.000 IU / mL; 0.2 mL / fare) uygulayın. 10 dakika sonra, fareleri sodyum pentobarbital (50 mg / kg, I.P. enjeksiyonu) ile uyuşturun ve farelerin kuyruk / ayak parmağı tutamaklarına yanıt vermeyi bıraktığından emin olun. Heparin uygulamasından 20 dakika sonra servikal çıkık yapın.
- Fareleri cerrahi platforma aktarın, fareleri sırtüstü pozisyonda sabitleyin, göğsü% 75 etanol ile sterilize edin ve gazlı bez veya peçete ile kurulayın.
3. Kalp Eksizyonu ve Aort Kanülasyonu
- Ksifoidin derisini doku forseps ile kaldırın ve doku makası ile deriden küçük bir yanal kesi yapın. Cilt ve fasya arasında künt bir diseksiyon yapın ve cildin kesisini V şeklinde her iki taraftaki koltuk altına doğru uzatın.
- Aynı kesi izine göğüs kafesi boyunca devam edin ve ardından kalbi ve akciğerleri tamamen açığa çıkarmak için sternumu doku forsepsleri ile sıkıştırarak göğüs kafesini yukarı doğru saptırın.
- Kavisli bir forseps kullanarak perikardları soyun. Timus bezini, büyük damarları kaplıyorsa, iki kavisli forseps ile her iki tarafa doğru yırtın. "Y" şeklinde bir kan damarı (aort ve dal arterleri) görünene kadar kalbin tabanını kavisli forseps ile yavaşça kuyruğa doğru çekin.
- Kanülasyon ve karşılaştırma için aortun farklı uzunluklarını ayırmak için, aortu sol ortak karotis arterden (Şekil 2'deki yeşil çizgi) kesin ve bazı farelerde brakiyosefalik arteri aynı anda kesin. Diğer farelerde çıkan aortta transekt (Şekil 2'deki siyah çizgi).
not: Bu prosedüre yeni başlayanlar için bu adım stereoskopik mikroskop altında da yapılabilir.
- Kalbi kesin ve kalan kanı yıkamak ve dışarı pompalamak için hemen Petri kabı 1'e daldırın.
- Kalbi Petri kabı 2'ye aktarın ve gerekirse ince iris makası kullanarak fazla dokuyu kesin. Bu prosedürde yeni olanlar için, aort veya diğer kalp yapılarını yanlışlıkla kesmekten kaçınmak için bu adımı stereomikroskop altında yapın.
- Aort kanülasyonundan önce hava kabarcıklarını dışarı atmak için şırıngayı itin. Stereomikroskop altında iki düz bağlama forseps (düz çene) yardımıyla retrograd aort kanülasyonu gerçekleştirin. Tüm kanülasyon işleminin sıvı yüzeyinin altında olduğundan emin olun.
- Aort kapaklarına nüfuz etmekten kaçının ve derinlikleri sırasıyla çıkan aorta (aortun sol ana karotid arterden kesildiği fare) ve aort köküne (aortun çıkan aortta kesildiği fare) ayarlayın.
not: Aort kanülasyonunun derinliği (kısaca derinlik olarak ifade edilir) burada kanül ucunun aort damarı içinde olduğu veya aortun bağlandığı pozisyon olarak tanımlanır.
- Aortu ön düğüm 3-0 dikiş ile kanül çentiğine bağlayın. Kalan kanı durulamak için şırınga içeriğine hafifçe bastırın.
not: Derinlik uygun şekilde konumlandırılmışsa, kan koroner arterlerden ayrılacak ve dorsal damarlardan dışarı çıkacaktır. Kalp ve atriyal uzantılar genişleyecek ve soluklaşacaktır.
- Kanülü çıkarın ve Langendorff cihazına bağlayın. Bir kez daha, kalbe herhangi bir hava kabarcığı girmemesine dikkat edin.
not: Torakotomiden ilk perfüzyona kadar geçen sürenin 5 dakikayı geçmemesi gerektiğini unutmayın.
- Kalp perfüzyonu için, atriyumda kalıntı kan varsa, önce oksijenli Tyrode solüsyonunu yaklaşık 10 saniye boyunca (bu protokolde kullanılan sistemde 10 saniye çalışan sıvı hacmi yaklaşık 0.7 mL'dir) prime ve perfüze edin ve ardından çözelti 1'e geçin. Bununla birlikte, kulakçıklarda artık kan yoksa çözelti 1 ile perfüze edin. Kalbi yaklaşık 2 dakika perfüze edin.
Tablo 1. Yetişkin fare CM izolasyonu için çözümler.
| çözüm | İçindekiler (farklı şekilde belirtilmemişse, mmol/L cinsinden nihai konsantrasyon) | Kaydetti |
| Perfüzyon çözeltisi (çözelti 1) | 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurin, 5 Glikoz, 10 2,3-bütandion monoksit (BDM) | 4 ° C'de 3 gün boyunca saklanabilir. Deney gününde glikoz, taurin ve BDM eklenir. Her kalp için 200 mL perfüzyon solüsyonu hazırlayın. |
| Tyrode'un çözümü (çözüm 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glikoz | 4 ° C'de 3 gün boyunca saklanabilir. Deney gününde CaCl2 ve Glikoz eklenir, bir PH metre ile oda sıcaklığında (28-30 ° C) doymuş NaOH ile pH'ı 7.3-7.4'e ayarlayın. |
Tablo 2. Yetişkin fare CM izolasyonu ve depolaması için çözümler.
| çözüm | Içeriği | Kaydetti |
| Sindirim çözeltisi (çözüm 3) | 25 mL çözelti 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg kollajenaz II, 50μL (% 2.5 %10×) tripsin | Her kalp için |
| Çözüm 1'i durdur (çözüm 4) | 9 mL çözelti 1, 1 mL FBS (Fetal Sığır Serumu), 4μL 100 mM/L CaCl2 | Her kalp için |
| Çözüm 2'yi durdur (çözüm 5) | 9.5 mL çözelti 1, 0.5 mL FBS (Fetal Sığır Serumu), 4μL 100 mM/L CaCl2 | Her kalp için |
| Hücre yeniden süspansiyon çözeltisi (çözelti 6) | 13 mL çözelti 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albümini) sıvının yüzeyini kaplayan ince bir tabaka oluşturabilecek bir dozda | Her kalp için |
