$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
.
1. Metilen Mavisi Boya Çözeltisinin Hazırlanması
- 0.1 g metilen mavisi tozu ölçün.
- Metilen mavisini 10 mL normal salin veya 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde girdaplama ile tamamen çözün.
- Enjeksiyon sırasında tıkanmayı önlemek için 10 mg / mL metilen mavisi çözeltisini bir şırınga filtresi (membran gözenek boyutu 0.45μm) ile filtreleyin.
- 3 mL tek kullanımlık şırınga ile steril bir kafa derisi damar seti (27 G x 3/4") birleştirin ve şırıngayı 3 mL filtrelenmiş metilen mavisi solüsyonu ile doldurun.
not: Hidrostatik basıncı ve ardından boya akışını önlemek için, iğne ucunu metilen mavisi çözeltisiyle doldurulmuş şırınganın üzerine yerleştirin.
2. Prenatal Embriyoların Diseksiyonu
- Diseksiyon makaslarını ve forsepsleri %70 etanol ile temizleyin.
- E18.5 veya E19.5'te perinatal embriyoları toplamak için, önce CO2 inhalasyonu kullanarak hamile farelere ötenazi yapın ve ardından NIH yönergelerine göre servikal çıkık gerçekleştirin.
not: Hamile dişi fare genellikle E18.5'ten başlayarak doğum yapar, ancak daha büyük böbreklerin manipüle edilmesi daha kolaydır. Bu nedenle, doğuma daha yakın olan E19.5'teki böbrekler üzerinde bu analizi yapmak daha kolaydır. Ancak iki taraflı idrar yolu tıkanıklığı olan yavrular doğumdan sonra ölürler. Deneysel farelerin özelliklerine bağlı olarak, uygun bir toplama günü/saati ampirik olarak belirlenmelidir.
- Ventral karın yüzeyine% 70 etanol püskürtün ve ardından diseksiyon makası ve forseps kullanarak karın boşluğunu ventral olarak açın.
- Rahim boynuzlarının uçlarından diseksiyon makası ile keserek tüm rahmi kaldırın ve vücuttan ayırın.
- Tüm uterusu bir Petri kabında 1x PBS ile durulayın.
- Uterusu diseksiyon makası ile segmental olarak kesin ve yumurta sarısı keselerindeki embriyoları ortaya çıkarmak için diseksiyon forseps ile plasental desiduayı çıkarın.
- Önce yumurta sarısı kesesini çıkarın ve ardından perinatal embriyoları serbest bırakmak için amniyotik zarı diseksiyon forsepsleri ile çıkarın.
- Diseksiyon makası ile bir embriyonun başını kesin. Fazla kanı steril gazlı bezle silin. Embriyoyu, görüntüleme için bir dijital kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu üzerinde ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde sabitleyin. Gerekirse genotipleme için kuyruğunu toplayın.
not: Her seferinde bir embriyo enjeksiyonu yapın.
- Cildi yırtarak bir embriyonun karın boşluğunu forseps ile dikkatlice açın. Daha sonra karaciğer, mide ve bağırsak gibi fazla organ ve dokuları forseps ile keserek veya dışarı çekerek böbrekleri, üreterleri ve dorsalde bulunan mesaneyi açığa çıkaracak şekilde dikkatlice çıkarın (Şekil 1A). Gerekirse steril gazlı bez pedleri ile diseke edilmiş embriyodan fazla kanı emdirin.
not: Fazla kan, boya enjeksiyonu için renal pelvisin tanımlanmasını engeller.
3. Metilen Mavisi Boyanın Renal Pelvise Enjeksiyonu ve Boya Akışının İzlenmesi
- metilen mavisi çözeltisini iğne ucundan hidrostatik basınçla dışarı atarak iğne ve borudaki kabarcıkları çıkarın. Akışı başlatmak için boya solüsyonunu içeren şırıngayı iğne ucu seviyesinin üzerine kaldırın ve ardından akışı durdurmak için şırıngayı indirin.
- İğneyi proksimal üreterin yakınındaki renal pelvise sokun ve yerleştirildikten sonra rahatsız etmemeye dikkat edin. İdrar yolu tıkanıklığını belirlemek için böbreğe boya enjeksiyonu yapın.
not: Herhangi bir anormal böbreğe boya enjeksiyonu yapın, önce idrar yolu tıkanıklığını belirlemek için aynı yolu izleyerek.
- Hidrostatik basınç sağlamak için şırıngayı yaklaşık 20 cm yukarı kaldırın ve 15 μL-60 μL boya çözeltisinin akmasına izin verin. Şırınga embriyonun üzerinde bu yüksekliğe kaldırılırsa akış hızı yaklaşık 3 μL/s olacaktır.
- Önce renal pelvisten başlayarak, daha sonra üreterin uzunluğunda ve son olarak mesane lümeninde boyanın mavi rengini izleyin.
not: Üreter mesaneye düzgün bir şekilde yerleştirilirse, mesane lümeninde zayıf bir boya renginin ortaya çıktığını görmek yaklaşık 5 saniye sürer. Mesane lümeninde boya rengi görünmüyorsa, boyanın tıkalı bölgede yaklaşık 15 saniye birikmesine izin verin.
- Boya akışını durdurmak için şırıngayı yere yerleştirin ve iğneyi böbrekten çıkarın.
- Stereomikroskoba bağlı kamera ve görüntüleme programını kullanarak boya solüsyonu ile izlenen böbrek, üreter ve mesanenin görüntülerini alın.
- Bir laboratuvar not defterinde böbreğin hidronefrozu, hidroüreter ve boya çözeltisinin son pozisyonunun bir kaydını yapın.
- Adım 3.1 ila 3.5'te tarif edildiği gibi kontralateral böbreğin enjeksiyonunu gerçekleştirin ve toplamda yaklaşık 20 saniye boya akışına izin verin.
not: Üreter mesane lümenine düzgün bir şekilde yerleştirilirse, mesane lümeni güçlü bir mavi renkle gösterilen boya çözeltisi ile doldurulacaktır. İdrar yolu bileşke tıkanıklığı değerlendirildikten sonra, üreterler ve mesane kesit alma için sabitlenebilir.
