$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Hayvanlar
- Yetişkin 3 ila 6 haftalık dişi fareleri kontrollü sıcaklık ve neme sahip bir odada tutun (12L: 12D fazları ile ve ad libitum ile beslenir).
- Folikül uyarıcı hormonun (FSH) etkilerini taklit ederek foliküler büyümeyi uyarmak için farelere intraperitoneal olarak 2.5 IU Gebe kısrak serumu gonadotropin (PMSG) enjekte edin. 48 saat sonra antral oosit toplanması için yumurtalıkları izole edin. Standart yönergelere göre daha önce PMSG enjekte edilen dişi fareye ötenazi yapın.
- Yumurtalıkları vücut boşluğundan hızlı bir şekilde çıkarın ve daha sonra oosit izolasyonu için M2 besiyeri içeren Petri kabına yerleştirin (bkz. bölüm 3).
- Karın duvarını kaplayan deride bir kesi yapın, ardından steril diseksiyon makası kullanarak peritonda bir kesi yapın. Karnı ortaya çıkarmak için kesiği açın, steril cımbız kullanarak bağırsakları bir tarafa hareket ettirin ve mesaneden başlayarak bir V şekli oluşturarak uterus tüplerini lokalize edin.
- Böbreklerin altında bulunan yumurtalıkları gözlemleyin. Her tüpü steril cımbızla tutun ve serbest bırakmak için yumurtalıkların dibinde küçük bir kesi yapın. Her iki yumurtalığı da önceden dengelenmiş ortam içeren bir Petri kabının dibine aktarın.
2. Hormon Hazırlama
- Uygun bir enjeksiyon hacmi için 0.1 mL başına 2.5 IU hormonunun çalışma konsantrasyonunu elde etmek için PMSG'yi (farklı stok konsantrasyonlarında mevcuttur) steril izotonik salin solüsyonu ile seyreltin.
not: Hormon solüsyonları 0,5 mL'lik tüplerde kullanılmalı ve kullanım gününe kadar -20 °C'de saklanmalıdır. Seyreltilmiş alikotları -20 °C'de üç aydan daha uzun süre tutmayın. Çözüldükten sonra, seri enjeksiyonlar yapılırsa, hormon çözeltilerinin alikotlarını +4 ° C'de saklayın ve 4 gün içinde kullanın.
3. Antral Oosit İzolasyonu
Uygun oosit izolasyonu için:
- Oosit izolasyon prosedürüne başlamadan önce M2 ortamını (M2) %5 CO2 ve 37 ° C'de en az 1 saat dengeleyin. Biri yumurtalık delme işlemi için 1 mL M2 ve ikincisi yumurtalıktan izolasyondan sonra oosit transferi için mineral yağ (~1,5 mL) ile kaplanmış küçük damlalar (20 μL) M2 içeren iki Petri kabı (35 mm x 10 mm) hazırlayın (bkz. adım 3.4-3.6). Her iki Petri kabını da kullanıma hazır olana kadar inkübatörde %5 CO2 ve 37 °C'de tutun.
- Oosit izolasyon işlemleri sırasında stereomikroskop kullanın.
- Yatay olarak tutulan cam Pasteur pipetlerini Bunsen brülöründen gelen dikey bir alev üzerine gererek (pipetin uçlarını iki elinizle tutarak) gererek oositleri toplamak için ince ağızlı cam pipetler hazırlayın (Şekil 1).
- Cam erimeye başladığında, pipeti alevden çıkarın ve istenen pipeti elde etmek için hızlı bir çekme hareketi yapın. İç kılcal damarın uzunluğunu ve çapını ayarlamak için fazla camı pipetin dar noktasına yakın bir yerde tırnaklarınızla sıkıca kesin. İnce kılcal damarın iç çapının ~100 μm, oositin çapından (~80 μm) biraz daha büyük olduğundan emin olun.
- Ağız pipetine için, aspiratör tüpünün bir ucunu uygun bir uç kullanarak çekilen pipete bağlayın ve diğer ucunu dişlerle sabitleyerek ağza yerleştirin.
- Steril cımbız kullanarak yumurtalıkları toplayın ve bir hücre kültürü Petri kabının (35 mm x 10 mm) dibine koyun. Bunları daha önce 37 °C'de dengelenmiş 1 mL M2 ve% 5 CO2 ile örtün (Şekil 2).
- M2'deki antral oositleri serbest bırakmak için yumurtalıkların antral foliküllerini steril bir insülin şırınga iğnesi ile nazikçe delin (Şekil 3).
- Folikül hücrelerini ve diğer olası doku kalıntılarını çıkarmak için oositleri dar bir Pasteur pipetinden nazikçe pipetleyin (Şekil 4A) ve ardından bunları embriyo kültürüne uygun mineral yağ ile kaplı küçük damlaların (20 μL) M2 dibine yerleştirin (önceden hazırlanmış; Şekil 4B).
not: Oositlerin zona pellucida'sına bağlı tüm kümülüs hücrelerinin, birkaç ve farklı M2 damlası boyunca sürekli pipetleme ile çıkarılması önemlidir. Ortamın pH'ında değişiklik olmasını önlemek için bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
