$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Çift reçine enjeksiyonları
- hazırlık
- Reçine çözeltisi hazırlayın. Çift sistem reçine enjeksiyonları için, 1.1.2-1.1.4 adımlarında açıklandığı gibi hem sarı hem de yeşil reçineleri hazırlayın.
- Fare başına 1 mL seyreltilmiş reçine hazırlayın.
- Sarı Reçine: Sarı reçineyi enjeksiyona hazırlamak için sarı silikon kauçuğu (yüksek radyoopasite) berrak seyreltici ile 3:1 seyreltmede seyreltin.
- Yeşil Reçine: Mavi reçine hazırlamak için mavi silikon kauçuğu (tespit edilemeyen radyoopasite) berrak seyreltici ile 1:1 seyreltmede karıştırın. Yeşil reçine oluşturmak için, seyreltilmiş mavi reçineyi seyreltilmiş sarı reçine ile 1:1 oranında karıştırın. Yeşil reçineyi renk homojen olana kadar iyice vorteksleyin.
not: Mavi reçine, mikroCT ile tespit edilemeyen çok düşük radyoopasiteye sahiptir, bu nedenle farklı radyoopasitelere sahip iki reçine oluşturmak için sarı reçine ile seyreltme gerektirir.
Dikkat: Reçine, kanserojen olan kurşun kromat içerebilir. Yangında zehirli gazlar üretir. Dikkatli tutun ve reçineyi tehlikeli atık olarak atın.
- 1.1.6-1.1.11.
adımlarında açıklandığı gibi borulu iki enjeksiyon seti (enjeksiyon seti #1 ve enjeksiyon seti #2) hazırlayın
not: Yetişkin fareler için (>P30 (doğum sonrası 30. gün) = P30 - 2 yıl), ortak safra kanalı enjeksiyonu için enjeksiyon seti #1 (0,6 mm dış çaplı PE10 hortumu) ve portal ven enjeksiyonu için enjeksiyon seti #2 (0,96 mm dış çaplı PE50 hortumu) kullanın. Genç doğum sonrası fareler için (P30'a kadar), biri safra kanalı ve diğeri portal ven enjeksiyonu için olmak üzere iki # 1 enjeksiyon seti hazırlayın (portal ven PE50 tüpünü barındıramayacak kadar dar olduğundan enjeksiyon seti #2 yok).
- Enjeksiyon seti #1'i hazırlamak için 30 cm PE10 borusunu kesin ve borunun bir ucunu mümkün olduğunca ince hale gelene kadar çekerek elle gerin (Şekil 1A,B, yaklaşık 0,15 mm çapında, gerilmemiş PE10 boru 0,6 mm çapındadır).
- Eğimli bir uç oluşturmak için gerilmiş PE10 borusunun ucunu çapraz olarak kesin (Şekil 1B).
- PE10 hortumunun gerilmemiş ucunu 30 G'lik bir iğneye bağlayın (Şekil 1A, Enjeksiyon seti #1).
- Enjeksiyon seti #2'yi hazırlamak için, 30 cm PE50 borusunu kesin ve borunun bir ucunu portal damara sığacak kadar ince hale gelene kadar çekerek elle gerin (Şekil 1A,B, yaklaşık 0.7 mm, gerilmemiş PE50 boru 0.96 mm çapındadır).
- Eğimli bir uç oluşturmak için gerilmiş PE50 borusunun ucunu çapraz olarak kesin (Şekil 1B).
- PE50 hortumunun gerilmemiş ucunu 23 G'lik bir iğneye bağlayın (Şekil 1A, enjeksiyon seti #2).
not: Reçine şırınga ve boruda sertleşeceği için her enjeksiyon seti yalnızca bir enjeksiyon için kullanılabilir. Yaşına bağlı olarak, farenin ortak safra kanalının ve portal veninin boyutuna göre gerilmiş ve eğimli ucun boyutunu ayarlayın, genotipine ve fenotipine bağlı olarak. Borunun boyutundan ve oturduğundan emin değilseniz, kesiden sonra ve boru reçine ile doldurulmadan önce boruyu uygun kanala veya kaba yerleştirin. Boru kanala/kaba sığamayacak kadar genişse, daha fazla gerin.
- Hayvanı izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon odasında ilk %4'ü ve burun konisi kullanılarak ~%2'si).
- Fare burun konisinden izofluran solurken fareyi bir diseksiyon pedi üzerindeki havalandırmalı bir tezgahın üzerine yerleştirin. Enstitü/IRB tarafından önerilen bir yöntemle, örneğin pençelerden birini sıkıştırarak hayvanın bilinçsiz olduğunu doğrulayın.
Dikkat: İzofluran, solunduğunda uyuşukluğa veya baş dönmesine neden olabilir ve uzun süreli veya tekrarlanan maruz kalma yoluyla kardiyovasküler sisteme ve merkezi sinir sistemine zarar verebilir. Solumayın. Maddeyi havalandırılan bir tezgahta ve iyi havalandırılan alanlarda tutun.
not: Kardiyak perfüzyon ile uyumlu olduğu sürece başka bir anestezi yöntemi kullanmak mümkündür.
- Hayvan bilinçsiz hale geldiğinde, kürkten kaynaklanan etkileşimi önlemek için ventral tarafa% 70 etanol püskürtün.
- Cilt makası kullanarak, karın boşluğunun orta hattından başlayarak cildi, fasyayı ve kas tabakasını kesin ve iç organları ortaya çıkarmak için göğüs boşluğuna kadar kesin.
- Sternumu kaldırmak için ksifoid sürecini forseps ile tutun ve kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için her iki taraftaki diyaframı ve göğüs kafesini kesin.
- Göğüs kafesinin sağ ve sol tarafında bulunan kaburgaları makasla keserek göğüs kafesini çıkarın. Karaciğere zarar vermemek için ekstra özen gösterin, çünkü bu reçinenin sızmasına neden olur.
- Düz forseps kullanarak kalbi karaciğere doğru çekin ve sağ atriyumu kesin.
- Sol ventriküle peristaltik perfüzyon pompasına bağlı bir kelebek iğne (23 G) yerleştirin. Fareyi Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ve heparin (fare vücut ağırlığının 1 U/g'u) ile transkardiyal olarak perfüze edin. 5 mL / dak perfüzyon hızı ile 3 dakika perfüs
not: Fare doğru şekilde perfüze edilirse, iç organlar, özellikle karaciğer soluklaşır. Bunun yerine, akciğerler beyaza dönüyorsa, iğne sağ ventriküle yerleştirilir ve yeniden konumlandırılmalıdır. Perfüzyondan sonra, fare kan durumuna düşürülür ve burun konisi ve izoflurandan çıkarılabilir.
- İzofluran pompasını kapatın.
2. Reçine enjeksiyonu - Biliyer sistem reçine döküm
- Fareyi diseksiyon mikroskobuna doğru hareket ettirin, karnı yukarı kaldırın, kuyruğunu deneyciye doğru hareket ettirin ve deneyciden uzaklaşın. İlgilenilen anatomik işaretler Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- Bağırsağı yana doğru hareket ettirerek inferior vena kava'yı bulun (Şekil 2A). Hepatik vasküler basıncın serbest bırakılmasına izin vermek için inferior vena kavada küçük bir enine kesi yapmak için yaylı makas kullanın (Şekil 2Bi).
- Ortak safra kanalını ve portal veni adım 1.2.4- 1.2.6'da açıklandığı gibi ortaya çıkarın.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) ile ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanarak bağırsak ve pankreası sağ tarafa (deneycinin) hareket ettirin.
- İç organı yüzeyi ve hiler bölgeyi ortaya çıkarmak için PBS ile ıslatılmış pamuklu çubuğu kullanarak karaciğerin ventral tarafını kalbe doğru çevirin.
- Hiler bölgesinden pankreas boyunca ve Oddi sfinkterinde bağırsağa uzanan ortak safra kanalını bulun (Şekil 2Bii, sarı noktalı çizgi ile özetlenen ortak safra kanalı, siyah ok uçları Oddi Sfinkterini gösterir).
not: PBS serperek işlem boyunca karaciğerin nemli olduğundan emin olun.
- Düz forseps kullanarak ortak safra kanalından çevreleyen dokuyu (alan ~ 5 mm) temizleyin. İpek dikiş ipini (4-0 boyutunda, 0.17 mm, 3-5 cm uzunluğunda) koledok kanalının altına yerleştirin (Şekil 2Bii) ve koledok kanalının etrafına gevşek bir el üstü düğüm atın (Şekil 2Biii).
not: Düğüm için hiler bölge ile Oddi sfinkteri arasında ve portal venden biraz uzakta bir alan seçin, böylece dikiş ortak safra kanalı etrafında sıkıldıktan sonra portal ven enjeksiyonuna müdahale etmeyecektir.
- Ortak safra kanalının Oddi sfinkterinin yanındaki pankreas ve bağırsağa girdiği noktada ortak safra kanalına eğik bir kesi yapmak için yaylı makası ortak safra kanalına karşı düz tutun. (Şekil 2Biv), sarı noktalı çizgi, siyah ok uçlarıyla vurgulanan Oddi bölgesinin sfinkterini ana hatlarıyla belirtir).
not: Bu çok önemli bir adımdır. Enine bir kesim değil, eğik bir kesim yapın ve bir kesi yapın; Safra kanalını kesmeyin. Tüm safra kanalının kesilmesi, borunun yerleştirilmesini çok zorlaştırır.
- Kullanmadan hemen önce, 1 mL sarı reçineyi 50 μL kürleme maddesi ile karıştırın (1 mL şırıngayı doldurup boşaltarak) ve 1 mL Luer şırıngasını reçine kürleme maddesi karışımı ile doldurun.
- Doldurulmuş şırıngayı boruya bağlayın (set #1). Hortumu tamamen doldurmak için pistona basın. Reçine/sertleştirici karışımının borunun ucundan damladığından emin olun.
not: En iyi sonuçlar için şırınga ve hortumdaki kabarcıklardan kaçının ve çıkarın.
- Forseps kullanarak, koledok insizyonunun etrafındaki alanı düzeltin ve boruyu, eğimli ucun en uzun kenarı safra kanalının dorsal tarafına doğru aşağı bakacak şekilde koledi kanalındaki açıklığa yerleştirin (Şekil 2Bv). Bu yönlendirme, reçinenin yukarı bakan boru açıklığından kanala çıkabilmesini sağlar (Şekil 2Bv).
- Boruyu ortak safra kanalının içine sabitlemek için ipek iplik düğümünü sıkın (Şekil 2Bvi).
- Reçineyi ortak safra kanalına enjekte edin. Safra kesesini ve tek tek karaciğer loblarını gözlemleyin.
- Reçinenin eşit şekilde yayılmasına yardımcı olmak için karaciğere PBS ile ıslatılmış bir pamuklu çubukla masaj yapın. Reçine dolu safra kanallarının terminal dalları (vahşi tip farelerde) karaciğer yüzeyinde belli belirsiz görülebilir.
not: Karaciğerin dolması için beklenen süre 30-100 saniyedir.
- Karaciğerin yüzeyinde reçine noktaları göründüğünde (Şekil 2Ci, mavi ok uçları) veya direnç karşılandığında reçineyi enjekte etmeyi bırakın.
not: Reçine kürleme maddesini ekledikten sonra reçine sertleşmeye başladığından mümkün olduğunca hızlı çalışın. Kürleme maddesinin eklenmesinden itibaren çalışma süresi yaklaşık 15 dakikadır.
- Boruyu ortak safra kanalından çekerek çıkarın ve reçinenin dışarı sızmasını önlemek için forseps kullanarak ipek düğümü hızla sıkın. İpek sütürün gevşek uçlarını kesin, böylece portal ven enjeksiyonuna müdahale etmezler.
- Reçine içeren boruyu ve kalan reçineyi tehlikeli atığa ve iğneyi kesici alet atığına atın.
