Fare Modelinde Sürekli İlaç İnfüzyon Sistemi: Sürekli İlaç Dağıtımı için Fare Beynine Mikro-ozmotik Pompa İnfüzyon Sistemini İmplante Etmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Özet

Kaynak: Ajoy, R., Chou, S. Y. Fare Beynine Sürekli İlaç İnfüzyon Sistemi ile Periferik Glukoz İntoleransına Hipotalamik İnsülin Sinyalinin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, bir mikro-ozmotik pompa beyin infüzyon sisteminin montajını ve ardından fare kafatasına cerrahi implantasyonunu gösteriyoruz. Bu sistem, potansiyel ilaçların sürekli olarak verilmesini sağlar ve bunların beyin ve beyin dokusu üzerindeki etkilerinin incelenmesini kolaylaştırır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Mikro-Ozmotik Pompa İnfüzyon Sistemlerinin Hazırlanması

NOT: Pompayı, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) tamponunu ve ilacı (Met-CCL5/RANTES protein solüsyonu (aCSF'de 10 ng/mL)) steril koşullar altında 0,2 μm filtrelerle filtrelenmiş tamponlar kullanarak hazırlayın ve tüm işlemleri kültür başlığı altında eldivenlerle gerçekleştirin. Ameliyat prosedürleri şu şekilde yapılır:

1. Mikro-ozmotik pompaları ameliyattan bir gün önce hazırlayın: Beyin mikro-ozmotik pompasını yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile 1 mL'lik bir şırınga ve kit ile birlikte verilen künt başlı iğne ile doldurun. Mikro-ozmotik pompayı aCSF'ye daldırın ve bir çalkalayıcıya yerleştirin ve gece boyunca hafifçe sallayın.
   DİKKAT: Pompa aCSF ile doldurulmalı ve pompanın içinde hava kabarcıklarından kaçınılmalıdır (Şekil 1A).
2. Ameliyata başlamadan önce, deneyde kullanılacak rekombinant Met-CCL5 / RANTES protein çözeltisini (10 ng / mL, aCSF'de seyreltilmiş) hazırlayın. BOS'u pompadan çıkarın ve fazla sızana kadar pompayı ilaç solüsyonuyla yavaşça doldurun.
   NOT: 5-8 pompa için 15 mL aCSF veya Met-CCL5/RANTES solüsyonu yeterlidir.
   DİKKAT: Pompanın içinde kabarcık olmadan ilaçla tamamen doldurulduğundan emin olmak için prosedürü tekrarlayın.
3. Kateter tüplerini istenen uzunlukta kesin ve beyin infüzyon kitindeki künt uçlu beyin infüzyon iğnesi ile takın. İnfüzyon kitini ve tüpleri ilaçla doldurun.
4. Son olarak, beyin infüzyon kitini mikro-ozmotik pompaya monte edin ve takın.
   DİKKAT: Boruda veya pompada kabarcık oluşmamalıdır (Şekil 1A).
5. Pompanın kurumasını önlemek için aCSF'deki tüm ozmotik pompa-beyin füzyon setini sterilize edilmiş 50 mL'lik bir tüpe daldırın. Ozmotik pompa-beyin füzyon seti artık ameliyat için kullanıma hazırdır.
   NOT: Mikro-ozmotik pompa sistemleri uzun süreli ilaç infüzyonu için kullanılabilir. Bu, fare beynine güvenli ve uygun bir ilaç verme modu sağlar.

2. İntraserebral Ventriküler Cerrahi – mikro ozmotik pompanın implantasyonu

DİKKAT: Cerrahi ortamı %75 etanol ile sterilize edin ve çalışmaya katılan kişilerin steril eldiven ve temiz laboratuvar önlüğü giydiğinden emin olun. Cerrahi aletler / aletler kullanımdan önce otoklavlanmalı ve kurutulmalı ve daha sonra fare ameliyatları arasında% 75 etanol ile sterilize edilmelidir.

1. Fareyi tartın ve Ketamin / Ksilazin (Ketamin 50 mg / kg, Ksilazin 10 mg / kg) ile intraperitoneal enjeksiyon (IP) kullanarak uyuşturun.
   DİKKAT: Vücut ağırlığı 24 g'dan düşük olan fareler ozmotik pompa implantasyon ameliyatı için önerilmez.
2. Fare kafasını stereotaktik aparata monte edin ve sabitleyin (Şekil 1B).
3. Kafatasını kaplayan dış deriyi kesmek için bir çift cerrahi makas ve kerpeten kullanın. Periferik kafatasını temizlemek için iyot kullanın.
4. Ozmotik pompa-beyin füzyon seti implantasyonu için boyun bölgesine yakın bir çift künt başlı kıskaç yardımıyla cildin en dış tabakasını cilt altı deriden ayırın (Şekil 1C).
5. Stereotaktik aparatı kullanarak infüzyon noktasını beyin haritasına (Şekil 1D) göre işaretleyin. Bu deneyde iğnenin 3. ventrikül bölgesine implante edilmesi gerekir (Bregma: 0.0 mm lateral, 1.3 mm posterior, 5.7 mm ventral).
6. Kafatası üzerinde işaretlenen alanın etrafına tırnak matkabı kullanarak bir delik açın (Şekil 1E).
   DİKKAT: Fare beyin zarlarını ve kan damarlarını kırmamaya dikkat edin, böylece beyindeki mikro kan damarlarının bozulmasını önleyin.
7. aCSF (kontrol olarak) veya ilaç (Met-CCL5/RANTES protein solüsyonu) içeren mikro-ozmotik pompa-beyin füzyon setini boyun bölgesinin arkasındaki cilt altına yerleştirin ve ilacı fare beynine infüze etmek için beyin infüzyon iğnesini açılan deliğe sokun (Şekil 1E). İğne meninkslere nüfuz edecek ve ventrikülün içine girecektir. Yüzey duyarsızlaştırıcı jel (Şekil 1F) kullanarak iğneyi kafatası üzerindeki yerine sabitleyin ve yapıştırıcı kuruyana kadar 1-2 dakika bekleyin. Ardından, iğnenin üstündeki çıkıntılı parçayı kesin (Şekil 1G-H).
8. Kafadaki ameliyat yarasını iyileştirmek için doku yapıştırıcı bir yapıştırıcı kullanın. Yaranın üzerine 50 μL yapıştırıcı sürün, cildin her iki tarafını birlikte çekin ve cildin sızdırmaz hale gelmesi için 30 saniye bekleyin (Şekil 1I).
   DİKKAT: Ameliyat sonrası yarayı temizlemek için% 100 alkollü ped ve enfeksiyonu önlemek için streptomisin ile 100 ul penisilin kullanın. NOT: Fare derisi, cerrahi yapıştırıcının uygulanmasını takiben birkaç gün içinde yara dokusu oluşturacak ve iyileşecektir. Yapıştırıcının ana avantajı, cilt tahrişine veya iltihaplanmaya neden olabilecek cerrahi dikişlerden kaçınılmasıdır.
9. Fareyi ılık bir tabakta (37 °C'ye kadar ısıtılmış) tutulan temiz bir kafese yerleştirin ve fare anestezik etkiden kurtulana kadar bekleyin.
   DİKKAT: Ameliyattan sonra hayatta kalma şansını artırmak için farenin vücut ısısını korumak çok önemlidir.
10. Bir haftalık iyileşme döneminden sonra, fareler Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT) ve İnsülin Tolerans Testi (ITT) gibi daha ileri deneyler için hazır olacaktır.

Sonuçlar

Şekil 1. Farede ozmotik pompa hazırlığı ve implantasyon cerrahi prosedürü. (A) Beyin infüzyon kiti ve pompa hazırlığı ilaç çözeltisi ile perfüze edilmiştir. Kırmızı oklar, sıvı ile doldurulmuş kateter tüplerini gösterir. (B) Fare kafasını stereotaktik cihaza sabitleyin ve monte edin. (C) Mikro-ozmotik pompa-beyin infüzyon setinin implantasyonu için cildin en dış tabak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Vetbond Doku Yapıştırıcısı	3 milyon	#1049SB	Fare kafasındaki lezyon bölgesini kapatmak için kullanılan yapıştırıcı
LOCTITE 454 anında yapıştırıcı	Durect Şirketi	#8670	İğneyi fare kafatasına sabitlemek için kullanılan yapıştırıcı
Alzet Mikro-Ozmotik Pompa	Durect Şirketi	#9922	Saatte 0.11 μl, 28 gün
Beyin infüzyon sistemi	Durect Şirketi	#8851	1-3 mm, ilacı farelerin beynine perfüze etmek için kullanılır
MIO NE116 KONTROL ÜNİTESİ (çivili matkap)	Mio Sistemi	#E235-015	Farenin kafatasında bir delik açmak için
aCSF formülü	119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glikoz		Filtre, 0.22 μm filtre aparatı ile sterilize edilir ve 4 ° C'de saklanır. aCSF 3-4 hafta boyunca stabildir