$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Farelerin hazırlanması ve juguler ven içine bir kateter yerleştirilmesi
NOT: Burada, erkek veya dişi, 5-7 haftalık mTmG raportör fareler kullanıldı (B6.129 (Cg) Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTBtdTomato, -EGFP) Luo10) Pf4-cre fareleri ile çaprazlandı, megakaryositlerde ve trombositlerde yoğun yeşil floresan etiketlemeye izin verdi. Deneye başlamadan önce, mikroskobun ısıtma odasını birkaç saat önceden ısıtın.
- Fareyi görüntüleme odasına taşıyın ve anesteziye devam edin.
Bir - ketamin (ketamin (100 μg/g) ve ksilazin (10 μg/g) (5 μL/g) çözeltisinin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun.
not: Tekrarlanan ketamin / ksilazin uygulaması burada kullanılır ve iyi çalışır ancak düzenli reenjeksiyon için kaydın kesilmesini gerektirir. Alternatif olarak, bir anestezi makinesi mevcutsa, anestezi indüksiyonu ketamin / ksilazin ile gerçekleştirilebilir ve daha sonra gazların (izofluran, hava ve oksijen karışımı) solunması altında tutulabilir.
- Derin anesteziye ulaşana kadar hayvanı kafesinde değiştirin. Sonraki tüm manipülasyonlar için fareyi 37 °C'de ısıtılmış ısıtılmış bir plakaya yerleştirin.
not: Hayvan derin anesteziye ulaşırken, mikroskobu ve tüm ekipmanı açın ve ameliyat tamamlandıktan sonra deneyi başlatmak için gereken farklı parametreleri ayarlayın. Burada prosedür sadece 3 saat sürer ve terminaldir. Fare, deneyden sonra uyanmadan ötenazi yapılır. Bu nedenle, cilt ve aletler için etanol dezenfeksiyonu yeterlidir. Bununla birlikte, kurumsal yönergelere bağlı olarak veya prosedürün daha uzun sürmesi durumunda, betadin/povidon ve alkol içeren üç alternatif ovma gibi daha eksiksiz dezenfeksiyon yöntemleri kullanılmalıdır.
2. Şah damarına bir kateter takın.
>NOT: Ameliyat sırasında mikrobiyal kontaminasyondan mümkün olduğunca kaçınmak önemlidir. Ameliyata devam etmeden önce cildi %70 etanol (EtOH) ile dikkatlice dezenfekte etmeye özen gösterin. Her zaman sterilize edilmiş makas ve cımbız kullanın ve bunları düzenli olarak% 70 EtOH ile durulayın. Temiz bir yerde çalışın ve yüz maskesi takın. İntravenöz enjeksiyon için plastik bir tüp içinde bir iğneden oluşan 22 G'lik bir "iğne üstü" kateter kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Fareyi sırt üstü yatırın ve boğazı germek için ön bacakları cerrahi bantla sabitleyin (Şekil 1A). Boğazı %70 etanol ile dezenfekte edin.
not: Kolaylık sağlamak için, ameliyattan önce boğaz tıraş edilebilir. İşlem daha uzun sürerse, uygun aseptik teknik için dikkatli tıraş yapılmalıdır.
- Steril makas kullanarak sağ veya sol şah damarı üzerinden 0,7-1 cm'lik bir kesi yapın. Dış juguler veni ve göğüs kasının üst kısmını ortaya çıkarmak için bitişik bağ dokusunu gerin (Şekil 1A).
- Kateteri ılık, steril fizyolojik tuzlu su ile doldurun. Göğüs kasından geçtikten sonra kateteri damar içine yerleştirin (Şekil 1B).
not: Kateterin içinde hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin. Kas bir sıkıştırma noktası oluşturacağı için kanamayı önlemek için kateterin kas içinden sokulması önemlidir. Itgb3-/- fareler gibi hemostaz kusurlu fareler bile bu yaklaşımla kateter yerleştirildiğinde kanama yapmaz.
- İğneyi nazikçe çıkarın ve gerekirse kateteri dikkatlice damarın daha derinlerine hareket ettirin. Şırıngayı bağlayın ve bir damla cerrahi yapıştırıcı ekleyerek kateteri stabilize edin (Malzeme Tablosu).
not: Kuyruk damarının içine bir kateter yerleştirmek mümkündür, ancak damar daha küçük bir kalibreye sahip olduğu için biraz pratik gerektirir. Bu, özellikle kuyruk damarı neredeyse hiç görünmeyen koyu saçlı fareler kullanıldığında zordur. Daha büyük kalibresi nedeniyle, kateterin juguler ven içine yerleştirilmesi, daha büyük hacimlerin veya tekrarlanan tedavilerin daha güvenilir bir şekilde enjekte edilmesine izin verebilir. Şırınganın ilk kez ılık tuzlu su ile doldurulduğunu lütfen unutmayın ve ilaç çözeltisini enjekte etmeden önce ölü hacmi enjekte etmeyi unutmayın.
- Fareyi dikkatlice yüzüstü konuma getirin (Şekil 1C). Kuruluğu önlemek için gözlere jel (Malzeme Tablosu) uygulayın.
