$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İntravital görüntüleme
- Lazer gücü de dahil olmak üzere intravital mikroskobu açın.
- Isıtma yastığını açın ve homeotermik düzenlemeyi 37 °C.
'ye ayarlayın
not: Alternatif olarak, homeotermik düzenleme yoksa sık kontrollü pasif bir ısıtma yastığı veya lamba kullanın.
- Önceden implante edilmiş pankreas penceresine sahip bir fareyi ele alalım. Tiletamin / zolazepam (30 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile kas içi anestezi uygulayın.
not: Hipergliseminin olumsuz etkisi nedeniyle ketamin yerine tiletamin / zolazepam kullanılması önerilir. Deneylerin amacına uygun olarak optimal anestezi seçilmelidir.
- Enjeksiyon için bir vasküler kateter yerleştirin.
- Turnike uygulamasına alternatif olarak kuyruğun proksimal tarafına işaret parmağı ve üçüncü parmağınızla baskı uygulayın. Gerekirse kuyruğu bir lamba ile ısıtın.
- Kuyruk damarını% 70 etanol spreyi ile sterilize edin.
- Lateral kuyruk damarına 30 G'lik bir kateter yerleştirin. Kanın yetersizliği PE10 tüpünde görüntülenecektir.
- Stabilize etmek için kateterin üzerine ipek bir bant uygulayın.
- Floresan probların kombinasyonuna göre uygun şekilde FITC / TMR dekstran veya diğer floresan probları (Alexa 647 ile konjuge edilmiş 25 μg anti-CD31) enjekte edin.
not: Floresan konjuge antikor probları için, görüntüleme seansından 2 saat önce enjekte edin.
- Fareyi cerrahi platformdan görüntüleme aşamasına aktarın.
- Homeotermik ısıtma yastığı sistemi ile vücut ısısını otomatik olarak kontrol etmek için bir rektal prob yerleştirin.
- Pankreas görüntüleme penceresini, intravital mikroskopi kurulumu sırasında hazırlanan pencere tutucusuna yerleştirin (Şekil 1). Ters çevrilmiş bir mikroskop için, bir pencere tutucusu gerekli olmayabilir.
- İntravital görüntüleme gerçekleştirin.
- Pankreası görüntülemek için, pankreas görüntüleme penceresinde pankreasın tüm görünümünü taramak için düşük büyütmeli bir objektif lens (örn. 4x) ile başlayın (önerilen görüş alanı: 2500 x 2500 μm).
- İlgilenilen bölgeyi belirledikten sonra, hücresel düzeyde görüntülemeyi gerçekleştirmek için daha yüksek büyütmeli objektif merceğe (20x veya 40x) geçin (önerilen görüş alanı: 500 x 500 μm veya 250 x 250 μm). Bu deneyde, yanal ve eksenel çözünürlük sırasıyla yaklaşık 0.5 μm ve 3 μm idi.
- 3D yapıyı veya hücre göçü gibi hücresel düzeydeki dinamikleri gözlemlemek için z-stack veya hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
not: Transgenik hayvanların floresan protein eksprese eden hücrelerinin (MIP-GFP) görüntülenmesi için, 0.43 mW'a kadar güçle 30 s aralıklı 488 nm lazer maruziyeti, gözle görülür fotoağartma veya doku hasarı olmadan tolere edilebilirdi. Alexa 647 ile etiketlenmiş floresan proteinleri görüntülemek için, 0,17 mW'a kadar 640 nm lazer gücü, gözle görülür foto ağartma veya doku hasarı olmadan tolere edilebilirdi. Bu ayarın üzerinde bir güçle uzun süreli uyarma lazerine maruz kalma, fotoağartmaya veya fototoksisite nedeniyle doku hasarına neden olabilir. İlgilenilen bölgeyi uygun şekilde görüntülemek için yeterli kazancı ve gücü ayarlayın. İntravital mikroskopideki parametrelerin ayrıntılı ayarı, enstitüde hazırlanan her intravital mikroskopi için kişiselleştirilmiştir.
