Antegrad Perfüzyon Modeli: İzole Fare Kalbini Perfüze Etmek İçin Ex Vivo Bir Teknik

Özet

Kaynak: Omatsu-Kanbe, M. ve diğerleri, Farelerden Kardiyomiyosit İzolasyonu için Bir Antegrad Perfüzyon Yöntemi. J. Vis. Exp. (2021).

Bu videoda, sol ventrikülden bir perfüzat enjekte edilen ve sonunda tüm miyokardiyumu perfüze eden izole bir fare kalbinin antegrad perfüzyon tekniği açıklanmaktadır. Bu yöntem, murin modellerinden kardiyomiyositleri izole etmek ve daha sonraki aşağı akış uygulamaları için hücreden arındırılmış kalpler oluşturmak için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Fare kalbinin antegrad perfüzyonu

NOT: Kalbi emmek için kullanılan plastik transfer pipeti yumuşak olmalı ve uca doğru keskin bir şekilde sivriltilmemelidir. Tırtıklı küçük bir vasküler klemp seçin. Önerilen cihazlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Fare kalbinin eksizyonu ve aort
   klemplemesi not: Yetişkin fareler (>8 haftalık) heparin (8000 birim / kg) ile aşırı dozda sodyum pentobarbital (>300 mg / kg, intraperitoneal [ip] enjeksiyonu) ile ötenazi yapılmalıdır.
   1. Fare kalbini emerek hızlı bir şekilde çıkarın.
      1. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu hızlı bir şekilde açın. Ucu açıkta kalan kalple yaklaşık olarak aynı boyutta veya ondan biraz daha küçük olan plastik transfer pipetini kesin (genellikle 0,5 mL işaretinden uca doğru yaklaşık 1 cm'lik bir bölgede, ancak bu kalp boyutuna bağlıdır).
      2. Kalbi pipetin içine emdirin, makas yerleştirmek için yeterli alan yaratmak için pipeti kaldırın ve kulakçıklara zarar vermekten kaçınarak kalbi sırt tarafından kavisli bir makasla çıkarın.
      3. Kasılmayı durdurmak için eksize edilen kalbi hemen buzla soğutulmuş CIB-EGTA içeren 30 mL'lik cam behere aktarın. Bu işlem genellikle <1 dakika sürer.
   2. Aort çevresinin temizlenmesi
      1. Kalbi buzla soğutulmuş CIB-EGTA ile doldurulmuş 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın ve akciğeri ve diğer görünür dokuları çıkarın ve ardından kabaca temizlenmiş kalbi soğutulmuş CIB-EGTA ile doldurulmuş kalp standına aktarın ve apeksi aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
      2. Stereoskopik mikroskop altında, aort çevresini temizlemek için yağ ve bağ dokularını çıkarın. Brakiyosefalik arter, sol ana karotid arter veya sol subklavyen arter dahil olmak üzere kesilen aortun uzunluğu çok uzunsa, bir sonraki adıma geçmek için brakiyosefalik arterin hemen altındaki aortu kısaltmak için kesin. Bu işlem genellikle yaklaşık 4 dakika sürer
   3. Aortun klemplenmesi ve klemplenen kalbin perfüzyon plağına yerleştirilmesi
      1. Enjeksiyon iğnesini yerleştirin ve kanı boşaltmak için perfüzyonu başlatın
         1. Mikroskop altında, kalbi kalp standına yerleştirin. Operatör kalbin ön yüzeyine bakmalı, aortun ucunu cımbızla kaldırmalı ve aortu hafifçe aşağı doğru iterken küçük bir vasküler klemp ile aortu atriyumun yanına yakın klemplemelidir.
         2. Kelepçelenmiş kalbi ön tarafı yukarı bakacak şekilde perfüzyon plakasına yerleştirin ve ardından kurumasını önlemek için birkaç damla CIB-EGTA ile örtün. Bu işlem genellikle <20 saniye sürer.
      2. Kalbin antegrad perfüzyonu
         not: İlk olarak, kanı boşaltmak ve pıhtılaşmayı önlemek için kalbi CIB-EGTA ile perfüze edin.
         1. Enjeksiyon iğnesini yerleştirin ve kanı boşaltmak için perfüzyonu başlatın
            1. Esnek uzatma tüpüne bağlı önceden ısıtılmış CIB-EGTA ile doldurulmuş 20 mL'lik şırıngayı ve infüzyon pompasına işaretli bir enjeksiyon iğnesini yerleştirin. İğneyi ve tüpü CIB-EGTA ile dikkatlice doldurmak için pompayı 0,5 mL/dk'lık yavaş bir hızda çalıştırın ve tüpe hava girmesini önlediğinizden emin olun.
            2. Enjeksiyon iğnesini, diyagonal şeklin kısa kenarı önde olacak şekilde perfüzyon plakasına yerleştirin. İğneyi kalbin tepesine dokunana kadar kaydırın ve ardından iğneyi sol ventrikülün tepesine yakın bir yerde bükmeden ventriküler odaya dikkatlice yerleştirin. Yerleştirme işlemini gerçekleştirirken iğneyi plakadan çıkarmayın.
            3. İğne batırma derinliğini tahmin etmek için kırmızı işarete dikkat edin. İğne yerleştirme işlemi tamamlandığında koroner arterden akan kan boşalmaya başlamalıdır.
            4. Enjeksiyon iğnesini plakaya bantla sabitleyin ve pompa hızını 1 mL/dk'ya yükseltin. Bu prosedür genellikle yaklaşık 30 saniye sürer. Kalp başarılı bir şekilde perfüze edilirse, epikardın hemen altındaki kılcal damardaki CIB-EGTA'nın akışı mikroskop altında görülebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Uzatma borusu	Top, Japonya	X1-50	Antegrad perfüzyon için şırınga ve enjeksiyon iğnesi ile bağlayın.
Isıtıcı paspas	Natsume Seisakusho, Japonya	KN-475-3-40	Perfüzyon plakasını ısıtmak için ekipman.
İnfüzyon pompası	TERUMO, Japonya	TE-311	Antegrad perfüzyon için infüzyon şırınga pompası.
Enjeksiyon iğnesi (27 gauge)	TERUMO, Japonya	NN-2719S	Sol ventrikül içine yerleştirmek için iğne.
İnsülin (sığır pankreazından itibaren)	Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik Devletleri	I5500 Serisi	0.1 m HCl'de çözülür.
Plastik şırınga (20 mL)	TERUMO, Japonya	SS-20ES	CIB-EGTA'nın infüzyonu için kullanın.
Vasküler kelepçe	Karl Hammacher GmbH, Almanya	SEÇ 004-35	Aortu klemplemek için kullanılan küçük düz vasküler kelepçe.
Diğer tüm reaktifler	Nacalai Tesque, Japonya

arası Serisi Serisi Serisi