İzole Murin Pulmoner Kapağın Basınç Fiksasyonu: Fare Pulmoner Kapağını Kapalı Konformasyonda İzole Etmek ve Kimyasal Olarak Sabitlemek İçin Bir Prosedür

Özet

Kaynak: Liu, Y., et al. Murin Pulmoner Kapağın Korkorelasyonik Görüntülenmesi için Cerrahi ve Örnek İşleme. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, perfüzyon basınçlandırma yoluyla kapalı konformasyonda fare pulmoner değerini izole etme ve kimyasal olarak sabitleme prosedürünü açıklıyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Pulmoner kapak eksizyonu

1. Fare diseksiyonu için gerekli araçları otoklavlayın. Buna ince makaslar, mikro forsepsler, mikro vasküler kelepçeler, kelepçe uygulama forsepsleri, mikro iğne tutucular, yaylı makaslar ve ekartörler dahildir.
2. Operasyondan en az 2 hafta önce tüm fareleri alıştırın. Yaklaşık 1 yaşında olan C57BL / 6 farelerini kafeslerinden çıkarın ve tartın, ardından bir ketamin / ksilazin kokteyli (3: 1 ketamin: ksilazin, g başına 0.01 mL) aşırı dozda ötenazi yapın.
3. Fareyi bir tepsiye sırt yaslanma pozisyonunda yerleştirin ve uzuvlarını bantla sabitleyin. Sabitlendikten sonra torakotomi yapın.
   1. Fazla yağ dokusunu ve fasyayı çıkararak kalbi açığa çıkarın.
   2. Sağ atriyumu çıkarın ve oda sıcaklığında tuzlu su çözeltisi (% 0.9 NaCl) ile sol ventrikülden perfüze edin. Perfüzyon 30 saniye boyunca yaklaşık 20 mL almalıdır. Bu, farenin kan kaybına neden olur.
4. Superior vena kava, inferior vena kava, pulmoner arter ve aortu keserek tüm kalbi çıkarın. Pulmoner arter için özel dikkat gösterilmelidir. Ventrikülo-arteriyel bileşkenin yaklaşık 2 mm yukarısından kesin, çünkü bu, basınçlandırma için kanal görevi görecektir.
5. Odaları atmosferik basınca maruz bırakmak için sol ve sağ ventrikülleri çıkarın. Pulmoner gövdenin yapısının, ventriküllerin çıkarılmasından etkilenmemesi gerektiğinden emin olun.

2. Pulmoner kapağın basınç fiksasyonu

1. Pulmoner arterli anastomoz basınçlandırma tüpü, broşürlerin ve pulmoner gövdenin büyük hareketlerine uyum sağlamak için sino-tübüler bağlantı ile borunun ucu arasında yaklaşık 1 mm mesafe bırakır.
2. Rezervuarı benzer bir fizyolojik basınca yükseltin ve tuzlu su çözeltisi ile doldurun. Tıkanıklık veya hava kabarcığı olmadığından emin olmak için akış sistemini test edin.
3. Anastomozlu pulmoner valfe bir vana takın ve çıkış yolunu değiştirerek borudan yeterli akışı (yani hava kabarcığı olmamasını) sağlayın. Akış yeterli olduğunda, çıkışı anastomozlu pulmoner valfe geçirin ve pulmoner gövdenin basınçlandırılmasını sağlayın. Bu, pulmoner gövde distansiyonu ile tanımlanır.
4. Pulmoner gövdenin basınçlandırılması onaylandıktan sonra, salin çözeltisi temizlenene kadar kademeli olarak birincil fiksatif çözeltiyi (% 1.25 glutaraldehit,% 0.15 M kakodilat içinde% 0.15 paraformaldehit) dahil edin. Bu, tuzlu su çözeltisinin rezervuar kapasitesinin yaklaşık% 25'i olan bir kısmının çıkarılması ve birincil fiksatif ile değiştirilmesiyle yapılır.
   Dikkat: Kullanılan fiksatifler (paraformaldehit ve glutaraldehit) oldukça toksiktir ve güvenliği sağlamak için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmelidir.
5. Kurumayı önlemek için doku örneğinin üzerine sabitleyici ile ıslatılmış bir gazlı bez yerleştirin.
6. Sabitleyiciyi 3 saat boyunca perfüze edin, sabit bir basıncı korumak için rezervuarı gerektiği gibi yeniden doldurun. Fiksasyon boyunca, kimyasal fiksasyon nedeniyle pulmoner kapağın küçülmesi nadir değildir. Bu durumda, fizyolojik basıncı korumak için rezervuarı sürekli olarak birincil fiksatif ile doldurun.
7. Kalp kapakçığını kullanana kadar fiksatif solüsyonda 4 °C'de saklayın. Numuneler, fark edilebilir bir fark olmaksızın 1 haftaya kadar saklandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%25 Gluteraldehit (AQ)	EMS	16210	Birincil fiksatif bileşen
% 0.9 sodyum klorür enjeksiyonu	Hospira A.Ş.	NDC 0409-4888-10
1 mL şırınga	Bd	309659
10 mL şırınga	Bd	309604
22G iğne	Bd	305156
3 musluk	Smiths Tıbbi ASD, Inc	MX5311L
% 4 Paraformaldehit (AQ)	EMS	157-4-100	Birincil fiksatif bileşen
C57BL/6 fare	Jackson Laboratuvarları	664	Yaklaşık 1 yo
Forsep uygulayan kelepçe	FST (Türkçe)	00072-14
Dumont #5 forsep	FST (Türkçe)	11251-20
Dumont #5/45 forseps	FST (Türkçe)	11251-35
Dumont #7 ince forsep	FST (Türkçe)	11274-20
İnce makas	FST (Türkçe)	14028-10
Tuzlu su çözeltisi (steril% 0.9 sodyum klorür)	Hospira A.Ş	NDC 0409-0138-22
Cerrahi mikroskop	Leica Belediyesi	M80
Tish iğne tutucu / forsep	Micrins (Mikronlar)	MI1540
Düzelt -ici	Ayhan	9854-500
Siyah poliamid monofilament sütür, 10-0	AROSurji Aletleri Şirketi	TI38402
Siyah poliamid monofilament sütür, 6-0	AROSurji Aletleri Şirketi	SN-1956
Ketamin hidroklorür enjeksiyonu	Hospira A.Ş	NDC 0409-2053
L-aspartik asit	Sigma-Aldrich	56-84-8	Boyama bileşeni
Kurşun nitrat	EMS	17900	Boyama bileşeni
Sodyum kakodilat trihidrat	Sigma-Aldrich	6131-99-3	arabellek
Dokumasız şarkılar	McKesson A.Ş.	94442000
Mikro adson forsep	FST (Türkçe)	11018-12
Millex-GP filtre, 0,22 um, PES 33mm, steril olmayan	EMD Kırlangıç	SLGP033NS

. Serisi Serisi Serisi . Gazetesi adet Gazetesi